"Att studera rollen av epigenetiska nyckelmedlare hos bröstcancerpatienter"

Bröstcancer anses vara en av de vanligaste maligniteterna hos kvinnor över hela världen och en av de vanligaste dödsorsakerna bland kvinnor globalt. Även med anmärkningsvärda framsteg inom diagnos och terapi är prognosen för bröstcancerpatienter fortfarande en besvikelse[1][2]. Bröstcancer är en mycket heterogen sjukdom som klassificeras i fyra subtyper baserat på uttrycket av vissa hormonella receptorer som östrogenreceptorn ER, progesteronreceptorn PR och human epidermal tillväxtfaktorreceptor HER2[2]. Följande är de fyra undertyperna av bröstcancer: Luminala A-tumörer kännetecknas av närvaron av ER och/eller PR och frånvaron av HER2, Luminal B-tumörer är av högre grad och sämre prognos jämfört med Luminal A, de är ER-positiva och kan vara PR-negativ och ha ett högt uttryck av Ki67 (större än 20%), den HER2-positiva gruppen utgör 10-15% av bröstcancerfallen och kännetecknas av högt HER2-uttryck med frånvaro av ER och PR och trippelnegativ bröstcancer som saknar uttrycket av de tidigare tre receptorerna[3][4].

Epigenetikreglering av genuttryck är förändringen i genuttrycksfunktionen utan att ändra nukleotidsekvensen. Både aktivering och inaktivering av cancerassocierade gener kan ske genom epigenetiska mekanismer. De viktigaste aktörerna i epigenetiska mekanismer för genreglering är DNA-metylering, histonmodifiering, kromatinremodellerare och icke-kodande RNA-uttryck [5].

Histonmodifieringar är en av de viktiga regulatorerna av kromatinstrukturen som är mycket avgörande för genuttryck eftersom det definierar tillgängligheten för DNA för transkriptionella regulatorer, påverkar genuttrycket och påverkar vitala cellulära processer [6].

Histonmodifieringar kan rekrytera transkriptionsfaktorer, kromatinremodellerare och kromatinstrukturproteiner, vilket bidrar till bildandet och upprätthållandet av aktivt eller repressivt kromatintillstånd[6]. De viktigaste histonmodifikationerna är: lysinacetylering, lysin- och argininmetylering, serin/treonin/tyrosinfosforylering och serin/treonin ubiquitylering [6]. Många av histonmodifieringsenzymer muteras ofta i olika typer av cancer till exempel: EHMT2 (G9A) kodar för ett metyltransferas som metylerar lysinrester av histon H3, metylering av H3 vid lysin 9 av detta protein resulterar i rekrytering av ytterligare epigenetiska regulatorer och repression av transkription. Histonmetyltransferaset G9a är väldokumenterat för dess implikation i neoplastisk tillväxt [7]. Ett annat exempel på histonmodifieringsenzymer är KMT5B (SUV420H1) ett metyltransferasenzym som katalyserar avsättningen av H4k20me-märket, ett repressivt märke och tros ha en tumörundertryckande roll i många cancertyper[8].

Kromatinstrukturen kan också regleras av kromatinremodellerares komplex, de är fyra konserverade familjer av ATP-beroende kromatinremodelers i däggdjur (CHD), (ISWI), (INO80) och (SWI/SNF), och är involverade i de flesta väsentliga cellprocesser [9].

Kromatinmodifieringsmaskineri är mycket oreglerat i cancer, inklusive bröstcancer, till exempel: mutationer eller inaktivering av gener som kodar för subenheter av SWI/SNF-komplexet finns i cirka 20 % av cancerfallen[10].

En annan viktig epigenetisk mekanism är effekten av icke-kodande RNA på genuttryck.

Icke-kodande RNA (ncRNA) är en heterogen grupp av transkript som inte översätts till proteiner. De har dykt upp som viktiga regulatorer av flera biologiska funktioner, och deras dysreglering har varit inblandad i sjukdomar inklusive cancer. De har fått ett enormt intresse bland forskarvärlden på grund av deras användning som sjukdomsbiomarkörer. Det finns många typer av ncRNA inklusive miRNA och lncRNA [11].

MikroRNA (miRNA) är små, mycket konserverade icke-kodande RNA-molekyler (18-25) nukleotider som är involverade i regleringen av genuttryck. Ackumulerande studier har identifierat att mikroRNA (miRNA) är nya regulatorer som fungerar som tumörsuppressorer eller onkogener i tumörprogression [12]. Det rapporterades att exosomal miR-138-5p utövar en onkogen funktion hos bröstcancerpatienter genom att hämma KDM6B-protein [13]. Peng Bian MD et al rapporterade att uttrycket av miR-4306 rapporterades vara nedreglerat i bröstcancervävnader jämfört med intilliggande vävnader [14].

Långa icke-kodande RNA (lncRNA) är en annan typ av icke-kodande RNA som är mer än 200 nukleotider långa och de flesta av dem är inte översatta till proteiner[15]. Trots det faktum att de flesta lncRNA inte översätts, har de fått ett stort intresse för forskning på grund av deras reglerande funktioner på genuttryck av andra målgener[15]. LncRNA reglerar genuttryck på epigenetiska, transkriptionella, posttranskriptionella, translationella och posttranslationella nivåer genom att interagera med mRNA, DNA, protein och miRNA [16]. Dessutom har de en avgörande roll för att upprätthålla biologiska processer som histonmodifiering, kromatinremodellering, transkriptionell interferens, transkriptionell aktivering, mRNA-translation och RNA-bearbetning[16]. Nyligen konstaterades det att lncRNA är involverade i många cancerformer som lungcancer, levercancer, prostatacancer, blåscancer och bröstcancer[2], så de kan användas som en ny biomarkör och farmaceutiskt mål i cancerterapi [17]. Till exempel främjar det onkogena lncRNA PVT1 spridningen av bröstcancerceller via miR-181a-2-3p/ESR1-axeln [18]. Viktigt är att lncRNA kan ha en överhörning med kromatinmodifierande och ombyggnadskomplex för att tätt reglera många normala cellulära vägar såväl som cancerframkallande vägar. De kan reglera kromatinmodifieringsmaskineriet antingen genom direkt interaktion eller indirekt via svampning av vissa miRNA. Exempel på direkt interaktion i cancer: LncRNA UCA1 reglerar kromatinremodellering via bindning med SMARCA4 för att försämra dess bindning till dess region på p21-promotorn vilket leder till blåscancerproliferation[19]. Exempel på indirekt interaktion i cancer: LncRNA-MIAT främjar sköldkörtelcancerprogression och fungerar som ceRNA för att rikta EZH2 genom att sponga miR-150-5p[20].

LncRNA kan detekteras i plasma/serum så fungerar som icke-invasiv biomarkör[21].

LncRNA UPK1A-AS1 är en nyligen identifierad biomarkör för cancer. Det rapporterades att det har en onkogen roll i bukspottkörtelcancer genom att ge platinaresistens genom reparation av dubbelsträngbrott[22]. Dessutom uppgavs att UPK1A-AS1 främjade spridningen av HCC genom att interagera med EZH2[23]. Trots det faktum att lncRNA UPK1A-AS1 rapporterades vara onkogen i HCC-, pankreascancer- och lungcancercellinjer, trodde man att det har en tumörundertryckande roll i esofagus skivepitelcancercellscancer via sponging miR-1248[24][24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 har erkänts som en onkogen i sköldkörtelcancer, prostatacancer och HCC [26] [27]. Det uppgavs också att det har onkogen roll i äggstockscancer genom att reglera histonmodifiering [28].

Rollen för lncRNAs UPK1A-AS1 och UNC5B-AS1 i patogenesen av bröstcancerpatienter har dock inte avslöjats ännu.

1.2. Problemdefinition. I Egypten är bröstcancer den vanligaste maligniteten bland kvinnor och de flesta fallen diagnostiseras i ett sent skede med dålig prognos[29]. Cirka 46 000 incidenter förutses år 2050. Även om incidensen i Egypten är lägre än de globala siffrorna, är dödligheten mycket högre om man jämför med de utvecklade länderna med ungefär 2 gånger (41% mot 23%) [30]. Så att tillhandahålla nya markörer för bröstcancerdiagnos och/eller prognos samt att förstå de molekylära mekanismerna bakom deras koppling till karcinogenes förblir en utmaning vid hantering och behandling av bröstcancer.

1.3. Hypotes. Eftersom problemformuleringen är att tillhandahålla nya markörer som inte har studerats hos bröstcancerpatienter tidigare för att hjälpa till vid diagnos och prognos för denna aggressiva sjukdom. Följaktligen kommer vi i denna studie att undersöka rollen av långa icke-kodande RNA UPK1A-AS1 och/eller UNC5B-AS1 som möjliga diagnostiska och/eller prognostiska markörer vid bröstcancer. Dessutom kommer den möjliga överhörningen och korrelationen mellan dessa långa icke-kodande RNA och kromatinmodifieringsenzymer och/eller ombyggnadskomplex som KMT5B och G9A via svampning av vissa mål-miRNA som mir-138-5p och mir-4306 att undersökas. 2. TIDIGARE STUDIER RESULTAT 2.1. Zhang et al. rapporterade att: UPK1A-AS1 främjar HCC-utveckling genom att accelerera cellcykelprogression genom interaktion med EZH2 och svampning av miR-138-5p [23].

2.2. Wang et al. rapporterade att: UNC5B-AS1 främjade äggstockscancerprogression genom att reglera H3K27me på NDRG2 via EZH2[28].

2.3. Hauang et al. rapporterade att: UNC5B-AS1 främjar spridning, migration och EMT av hepatocellulära karcinomceller via reglerande miR-4306/KDM2A-axel [26].

3. SYFTE MED ARBETET Att uppskatta uttrycksnivåerna för våra kandidat-lncRNA UPK1A-AS1 och/eller UNC5B-AS1 och korrelera det med olika kliniska parametrar hos bröstcancerpatienter och belysa deras möjliga överhörning med kromatinmodifierande och/eller omformande proteiner som KMT5B och G9A hos bröstcancerpatienter via sponging av vissa mål-miRNA som mir-138-5p och mir-4306.

4. FORSKNINGSMÅL 4.1. Mät lncRNA UPK1A-AS1 och/eller UNC5B-AS1 och deras målmiRNAs genuttryck i serumprover (vätskebiopsi) och/eller vävnadsprover från bröstcancerpatienter, med hjälp av kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktionsteknik (qRT-PCR).

4.2. Mät nivån av serum- och/eller vävnadsmålproteiner med ELISA. 4.3. Jämför dessa ncRNAs uttrycksnivåer med de klassiska proteintumörmarkörerna, 4.4. Korrelera dessa ncRNA och målproteinnivåaxeln till bröstcancers klinisk-patologiska egenskaper som tumörstadium och -grad, tumörprogression (TNM) och andra klassiska klinisk-patologiska prognostiska biomarkörer såsom karcinoembryonalt antigen (CEA), cancerantigen 15-3 (CA15-3) ), (ER), (PR), human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2/neu), spridningsmarkören Ki-67 eller PCNA och fullständigt blodvärde (CBC), BMI, BP, blodsockernivå och insulin.

5. FORSKNINGSRESULTAT 5.1. Primär. Belysa rollen för våra kandidat-lncRNA och deras nedströmsmål erhållna från bröstcancerpatienters flytande biopsi och/eller vävnadsprover.

5.2. Publikation(er)/Synlighetsresultat. Recensionsartikel + en internationell Scopus Q1-publikation som tar upp resultat som hittats + presenterar resultat på en internationell konferens med högt anseende.

6. FORSKNINGENS BETYDNING 6.1. Så vitt vi vet är detta det första forskningsarbetet som mäter uttrycksnivån för UPK1A-AS1 och/eller UNC5B-AS1 i kliniska prover för bröstcancer.

6.2. Dessa data skulle kunna ge ett lovande tillvägagångssätt för att introducera en ny markör som hjälper till vid diagnos och prognos av bröstcancer och ger ett potentiellt mål för genterapi.

7. FORSKNINGSMETOD 7.1. Bioinformatikanalys 7.1.1. Undersöker vår kandidat-lncRNA-uttryck i bröstcancerprover från genuttrycksprofilerande interaktiv analys (GEPIA) baserat på data från The Cancer Genome Atlas-data (TCGA).

7.1.2. Undersöka mål miRNA med hjälp av bioinformatikverktyg och/eller experimentella studier med hjälp av onlineprogramvaran miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Undersöker utvalda miRNAs målgener via miRNA onlineverktyg: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase eller ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ och målskanning: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Pathway-analys eller Gene Ontology för lista över målgener via anrikningsdatabas, listan över målgener analyserades för deras relation med kromatinmodifierande och/eller omformande proteiner.

8. ETISK UTTALANDE 8.1.1. Denna forskning kommer att utföras i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Helsingforsdeklarationen med hänvisning till World Medical Associations (WMA) etiska riktlinjer för medicinsk forskning med människor, som ursprungligen publicerades 1964, reviderades 2013 och oktober 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Prover kommer att samlas in efter deltagarens tillkännagivande och undertecknande av informerat samtycke.

8.1.2. Etiskt godkännande och samtycke till att delta. Denna studie godkändes först av forskningsetiska kommittén (REC) vid Fakulteten för farmaci, Ain Shams University 9. PROVSTORLEK OCH STUDIEKRAFT 9.1. Uppskattad provstorlek beräknades med G power* provstorlek online-kalkylator http://www.gpower.hhu.de/en.html, med hjälp av följande indata: α felsannolikhet är (0,05), studiekraften (0,8). Baserat på de tidigare studierna utförda av Bian et al, 2021; Huang et al, 2021; Tan et al, 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25] som visade måttlig till hög effektstorlek, en måttlig effektstorlek (0,5) valdes för att beräkna provstorleken.

Den totala urvalsstorleken kommer att vara 102 fall, detta antal kommer att delas in i 2 grupper antingen efter förhållandet 50:50 eller efter förhållandet 60:40.

9.2. Studiedesign. Fallkontrollerad, retrospektiv, monocenterstudie. 9.3. Studiedeltagare. En serie egyptiska kvinnliga bröstcancerpatienter kommer att rekryteras från bröstcancerenheten, Clinical Oncology Department, Ain Shams University, Kairo, Egypten.

Grupp 1; maligna icke-metastaserande bröstcancerpatienter; nydiagnostiserade bröstcancerpatienter.

Grupp 2; kontrollgrupp; friska frivilliga. 9.3.1 Klinisk-patologisk Kriterier. Kliniska data erhållna från journaler och de ursprungliga patologirapporterna. Dessa data ska sammanställas i en detaljerad Excel-fil.

Följande kliniska data ska registreras och bedömas som i den bifogade excel-filen.

• Fullständig familjehistoria kommer att registreras för alla deltagare i bröstcancer.
• Individuell cancerhistoria och den kliniska bedömningen av tumörer som gjorts med hjälp av (TNM) klassificeringen av American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Bloom-Richardson-skalan kommer att användas för histologisk gradering.
• Bröstcancerpatienternas egenskaper med avseende på kroppsmassaindex (BMI), CBC, klimakteriet, histopatologiska typer av bröstcancer; invasivt duktalt karcinom (IDC) och invasivt lobulärt karcinom (ILC). Bröstcancer molekylära klassificeringar luminal A, B, trippelnegativ bröstcancer.
• Tumörstorlek, såväl som klinisk-patologiska biomarkörer CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 eller PCNA (om någon) data kommer att samlas in från patientfiler för ytterligare korrelationer och statistisk analys.

9.3.2. Inklusionskriterier; Egyptiska kvinnor med bröstcancerpatienter i åldern 18 år och äldre, nyligen diagnostiserade med bröstcancer.

9.3.3 Uteslutningskriterier; blodsjukdomar, annan cancer än bröstcancer, levercirros och livmoder- och urinblåssjukdomar eller bröstcancerpatienter med några tecken på fjärrmetastaser.

9.4. Blodprovtagning: 6 ml perifert blod kommer att samlas in i polymergelvacutainrar med koagelaktivator (Greiner Bio-One GmbH, Australien), lämnas i 15 minuter. vid rumstemperatur för att koagulera, följt av en 10 min. centrifugering vid 10 000 g vid 4°C kommer erhållna sera att delas upp i 5 rena Eppendorf-rör och förvaras vid -80°C, fram till biokemisk bedömning vid biokemiska institutionen, farmaceutets fakultet, Ain-Shams University.

9.4.1 Lagrade sera kommer att användas för ELISA-teknikmätningar av målproteinnivåer, med kommersiellt tillgängliga ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.

9.4.2. Genomiskt RNA kommer att extraheras; ncRNA-extraktion från serumprover och reningsutvärdering. ncRNAs uttrycksnivå kvantifiering, med användning av qRT-PCR genom steg ett plus. Vi kommer att fortsätta med total RNA-extraktion från serumprov med miRNeasy Mini Kit. c-DNA-syntesen kommer att göras efteråt med VERSO c-DNA-syntesskit (Thermo Scientific, USA).

Därefter kommer vi att utföra kvantitativa realtids-PCR-analyser (qRT-PCR) med hjälp av sybr-grön PCR-mastermix (Thermo Scientific, USA) och specifika primrar designade för mål-ncRNA såväl som hushållningsreferensgenen.

10. STATISTISK ANALYS 10.1. Data kommer att samlas in, Excel-tabell, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) version 20, kommer att vara det använda programmet eller Stat4 eller Graphpad Prism för figurer, 10.3. Data kommer att testas för normalitet av Shapiro-Wilk-kalkylatorn, 10.3.1. Normalfördelade variabler ska uttryckas som medel+(S.E.M) och analyseras med hjälp av två stickprov oberoende student t-test och ANOVA ska användas för jämförelse av 2 eller flera grupper, om de är normalfördelade, respektive.

10.3.2. Justering och normalisering för confounders som ålder och BMI, .. mellan kontroll och patienter samt multipel regressionsanalys eller ANCOVA för att förutsäga en confounder, 10.3.3. Data som ska presenteras som median (intervall), om den inte är normalfördelad, kommer Mann-Whitney (U) eller Kruskal-Wallis (H) att utföras för att jämföra mellan två eller flera oberoende grupper, respektive, 10.4. P-värdena var tvåsidiga och ansågs signifikanta om P <0.05.11.