„Badanie roli kluczowych mediatorów epigenetycznych u pacjentów z rakiem piersi”

Rak piersi jest uważany za jeden z najczęstszych nowotworów złośliwych u kobiet na całym świecie i jedną z głównych przyczyn zgonów wśród kobiet na całym świecie. Pomimo niezwykłego postępu w diagnostyce i terapii rokowanie u pacjentów z rakiem piersi pozostaje rozczarowujące[1] [2]. Rak piersi jest wysoce heterogenną chorobą, którą dzieli się na cztery podtypy w oparciu o ekspresję pewnych receptorów hormonalnych, takich jak receptor estrogenowy ER, receptor progesteronowy PR i receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu HER2[2]. Wyróżnia się cztery podtypy raka piersi: Guzy luminalne A charakteryzują się obecnością ER i/lub PR oraz brakiem HER2, Guzy luminalne B mają wyższy stopień złośliwości i gorsze rokowanie w porównaniu z luminalnymi A, są ER-dodatnie i może być PR-ujemny i mieć wysoką ekspresję Ki67 (powyżej 20%), grupa HER2-dodatnia stanowi 10-15% nowotworów piersi i charakteryzuje się wysoką ekspresją HER2 przy braku ER i PR oraz potrójnie ujemny rak piersi, w którym brakuje ekspresji trzech poprzednich receptorów [3] [4].

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów to zmiana funkcji ekspresji genów bez zmiany sekwencji nukleotydów. Zarówno aktywacja, jak i inaktywacja genów związanych z nowotworem może nastąpić poprzez mechanizmy epigenetyczne. Głównymi uczestnikami epigenetycznych mechanizmów regulacji genów są metylacja DNA, modyfikacja histonów, remodelery chromatyny i ekspresja niekodującego RNA [5].

Modyfikacje histonów są jednym z ważnych regulatorów struktury chromatyny, niezwykle istotnym dla ekspresji genów, gdyż określają dostępność DNA dla regulatorów transkrypcji, wpływają na ekspresję genów i istotne procesy komórkowe [6].

Modyfikacje histonów mogą rekrutować czynniki transkrypcyjne, remodelery chromatyny i białka strukturalne chromatyny, przyczyniając się w ten sposób do tworzenia i utrzymywania aktywnego lub represyjnego stanu chromatyny [6]. Do najważniejszych modyfikacji histonów zalicza się: acetylację lizyny, metylację lizyny i argininy, fosforylację seryny/treoniny/tyrozyny oraz ubikwitylację seryny/treoniny [6]. Wiele enzymów modyfikujących histony jest często mutowanych w różnych typach nowotworów, na przykład: EHMT2 (G9A) koduje metylotransferazę, która metyluje reszty lizyny histonu H3, Metylacja H3 w lizynie 9 przez to białko skutkuje rekrutacją dodatkowych regulatorów epigenetycznych i represją transkrypcja. Metyltransferaza histonowa G9a jest dobrze udokumentowana pod względem jej wpływu na rozwój nowotworu [7]. Innym przykładem enzymów modyfikujących histony jest KMT5B (SUV420H1), enzym transferaza metylowa, który katalizuje odkładanie się znaku H4k20me, znaku represyjnego i uważa się, że pełni rolę supresora nowotworu w wielu typach nowotworów [8].

Strukturę chromatyny można również regulować za pomocą kompleksów remodelerów chromatyny. Są to cztery konserwatywne rodziny zależnych od ATP remodelerów chromatyny u ssaków (CHD), (ISWI), (INO80) i (SWI/SNF) i biorą udział w większości podstawowe procesy komórkowe [9].

Mechanizm modyfikacji chromatyny jest silnie rozregulowany w przypadku nowotworów, w tym raka piersi, na przykład: mutacje lub inaktywację genów kodujących podjednostki kompleksu SWI/SNF stwierdza się w około 20% nowotworów[10].

Innym ważnym mechanizmem epigenetycznym jest wpływ niekodujących RNA na ekspresję genów.

Niekodujące RNA (ncRNA) to heterogenna grupa transkryptów, które nie ulegają translacji na białka. Okazały się ważnymi regulatorami wielu funkcji biologicznych, a ich rozregulowanie powiązano z chorobami, w tym rakiem. Zyskały one ogromne zainteresowanie społeczności naukowej ze względu na zastosowanie ich jako biomarkerów chorób. Istnieje wiele typów ncRNA, w tym miRNA i lncRNA [11].

MikroRNA (miRNA) to małe, wysoce konserwatywne, niekodujące cząsteczki RNA (18-25) nukleotydów zaangażowane w regulację ekspresji genów. Coraz liczniejsze badania wykazały, że mikroRNA (miRNA) to nowe regulatory działające jako supresory nowotworów lub onkogeny w progresji nowotworu[12]. Doniesiono, że egzosomalny miR-138-5p wywiera funkcję onkogenną u chorych na raka piersi poprzez hamowanie białka KDM6B [13]. Peng Bian MD i wsp. donieśli, że doniesiono, że ekspresja miR-4306 jest obniżona w tkankach raka piersi w porównaniu z sąsiadującymi tkankami [14].

Długie niekodujące RNA (lncRNA) to inny rodzaj niekodujących RNA, które mają długość ponad 200 nukleotydów i większość z nich nie ulega translacji na białka [15]. Pomimo tego, że większość lncRNA nie ulega translacji, cieszą się one ogromnym zainteresowaniem w badaniach ze względu na ich funkcje regulacyjne dotyczące ekspresji innych genów docelowych[15]. LncRNA regulują ekspresję genów na poziomie epigenetycznym, transkrypcyjnym, potranskrypcyjnym, translacyjnym i potranslacyjnym poprzez interakcję z mRNA, DNA, białkiem i miRNA [16]. Dodatkowo odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu procesów biologicznych, takich jak modyfikacja histonów, przebudowa chromatyny, interferencja transkrypcji, aktywacja transkrypcji, translacja mRNA i przetwarzanie RNA [16]. Ostatnio stwierdzono, że lncRNA biorą udział w wielu nowotworach, takich jak rak płuc, rak wątroby, rak prostaty, rak pęcherza moczowego i rak piersi[2], dlatego mogą być stosowane jako nowy biomarker i cel farmaceutyczny w terapii nowotworów [17]. Na przykład onkogenny lncRNA PVT1 promuje proliferację komórek raka piersi poprzez oś miR-181a-2-3p/ESR1 [18]. Co ważne, lncRNA mogą mieć przesłuch z kompleksami modyfikującymi i przebudowującymi chromatynę, aby ściśle regulować wiele normalnych szlaków komórkowych, a także szlaki rakotwórcze. Mogą regulować mechanizm modyfikacji chromatyny poprzez bezpośrednią interakcję lub pośrednio poprzez przenikanie niektórych miRNA. Przykład bezpośredniej interakcji w przypadku raka: LncRNA UCA1 reguluje przebudowę chromatyny poprzez wiązanie się ze SMARCA4, osłabiając jej wiązanie z regionem na promotorze p21, co prowadzi do proliferacji raka pęcherza moczowego [19]. Przykład pośredniej interakcji w przypadku raka: LncRNA-MIAT promuje postęp raka tarczycy i działa jako ceRNA celujący w EZH2 poprzez gąbkowanie miR-150-5p [20].

LncRNA można wykryć w osoczu/surowicy, dzięki czemu pełnią one funkcję nieinwazyjnego biomarkera[21].

LncRNA UPK1A-AS1 to nowo zidentyfikowany biomarker nowotworu. Donoszono, że odgrywa onkogenną rolę w raku trzustki poprzez nadawanie oporności na platynę poprzez naprawę pęknięć podwójnej nici [22]. Ponadto stwierdzono, że UPK1A-AS1 promuje proliferację HCC poprzez interakcję z EZH2 [23]. Pomimo faktu, że donoszono, że lncRNA UPK1A-AS1 jest onkogenny w liniach komórkowych HCC, raka trzustki i raka płuc, uważano, że pełni on rolę supresora nowotworu w przypadku raka płaskonabłonkowego przełyku poprzez gąbkowanie miR-1248 [24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 uznano za onkogen w raku tarczycy, raku prostaty i HCC[26] [27]. Stwierdzono także, że pełni onkogenną rolę w raku jajnika poprzez regulację modyfikacji histonów [28].

Jednakże rola lncRNA UPK1A-AS1 i UNC5B-AS1 w patogenezie chorych na raka piersi nie została dotychczas poznana.

1.2. Definicja problemu. W Egipcie rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet, a większość przypadków jest rozpoznawana w późnym stadium i wiąże się ze złym rokowaniem[29]. Prognozuje się, że w 2050 r. wystąpi około 46 000 incydentów. Choć zapadalność w Egipcie jest niższa niż na świecie, śmiertelność jest znacznie wyższa w porównaniu z krajami rozwiniętymi, około 2-krotnie (41% v 23%) [30]. Zatem dostarczenie nowych markerów do diagnostyki i/lub rokowania raka piersi, a także zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ich powiązania z karcynogenezą pozostaje wyzwaniem w leczeniu raka piersi.

1.3. Hipoteza. Celem problemu jest dostarczenie nowych markerów, których nie badano wcześniej u pacjentów z rakiem piersi, aby pomóc w diagnozowaniu i prognozowaniu tej agresywnej choroby. W związku z tym w niniejszym badaniu zbadamy rolę długich niekodujących RNA UPK1A-AS1 i/lub UNC5B-AS1 jako możliwych markerów diagnostycznych i/lub prognostycznych w raku piersi. Ponadto zbadany zostanie możliwy przesłuch i korelacja między tymi długimi niekodującymi RNA a enzymami modyfikującymi chromatynę i/lub kompleksami przebudowującymi, takimi jak KMT5B i G9A, poprzez gąbkowanie pewnych docelowych miRNA, takich jak mir-138-5p i mir-4306. 2. WYNIKI Z POPRZEDNICH BADAŃ 2.1. Zhang i in. podali, że: UPK1A-AS1 promuje rozwój HCC poprzez przyspieszanie postępu cyklu komórkowego poprzez interakcję z EZH2 i gąbkowanie miR-138-5p [23].

2.2. Wang i in. podali, że: UNC5B-AS1 promuje progresję raka jajnika poprzez regulację H3K27me na NDRG2 poprzez EZH2 [28].

2.3. Hauang i in. podali, że: UNC5B-AS1 promuje proliferację, migrację i EMT komórek raka wątrobowokomórkowego poprzez regulację osi miR-4306/KDM2A [26].

3. CEL PRACY Oszacowanie poziomu ekspresji naszych kandydatów na lncRNA UPK1A-AS1 i/lub UNC5B-AS1 i powiązanie go z różnymi parametrami klinicznymi u chorych na raka piersi oraz rzucenie światła na ich możliwy przesłuch z białkami modyfikującymi i/lub przebudowującymi chromatynę jako KMT5B i G9A u pacjentów z rakiem piersi poprzez gąbkowanie pewnych docelowych miRNA, takich jak mir-138-5p i mir-4306.

4. CEL(Y) BADAŃ 4.1. Zmierzyć lncRNA UPK1A-AS1 i/lub UNC5B-AS1 oraz ekspresję ich docelowego genu miRNA w próbkach surowicy (biopsja płynna) i/lub próbkach tkanek od pacjentów z rakiem piersi, stosując ilościową technikę łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR).

4.2. Zmierzyć poziom docelowych białek w surowicy i/lub tkance za pomocą testu ELISA. 4.3. Porównaj poziom ekspresji tych ncRNA z klasycznymi białkowymi markerami nowotworowymi, 4.4. Powiązać te ncRNA i oś poziomu białka docelowego z kliniczno-patologiczną charakterystyką raka piersi, takimi jak stadium i stopień nowotworu, progresja nowotworu (TNM) i innymi klasycznymi kliniczno-patologicznymi biomarkerami prognostycznymi, takimi jak antygen rakowo-embrionalny (CEA), antygen nowotworowy 15-3 (CA15-3) ), (ER), (PR), receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2/neu), marker proliferacji Ki-67 lub PCNA i pełna morfologia krwi (CBC), BMI, BP, poziom glukozy we krwi i insulina.

5. WYNIKI BADAŃ 5.1. Podstawowy. Wyjaśnij rolę naszych kandydatów na lncRNA i ich dalsze cele uzyskane z płynnej biopsji i/lub próbek tkanek pacjentów z rakiem piersi.

5.2. Publikacje/wyniki widoczności. Artykuł przeglądowy + jedna międzynarodowa publikacja Scopus Q1 opisująca znalezione wyniki + prezentacja ustaleń na międzynarodowej konferencji cieszącej się dobrą reputacją.

6. ZNACZENIE BADAŃ 6.1. Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwsza praca badawcza mierząca poziom ekspresji UPK1A-AS1 i/lub UNC5B-AS1 w próbkach klinicznych raka piersi.

6.2. Dane te mogą zapewnić obiecujące podejście do wprowadzenia nowych markerów, które pomogą w diagnozowaniu i prognozowaniu raka piersi oraz będą potencjalnymi celami terapii genowej.

7. METODOLOGIA BADAŃ 7.1. Analiza bioinformatyczna 7.1.1. Badanie ekspresji naszego potencjalnego lncRNA w próbkach raka piersi na podstawie interaktywnej analizy profilowania ekspresji genów (GEPIA) w oparciu o dane z Atlasu genomu raka (TCGA).

7.1.2. Badanie docelowych miRNA za pomocą narzędzi bioinformatycznych i/lub badań eksperymentalnych z wykorzystaniem oprogramowania internetowego miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Badanie wybranych genów docelowych miRNA za pośrednictwem narzędzi internetowych miRNA: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase lub ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ i skan celu: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Analiza ścieżki lub ontologia genów w celu uzyskania listy genów docelowych za pośrednictwem bazy danych wzbogacających, listę genów docelowych analizowano pod kątem ich związku z białkami modyfikującymi i/lub przebudowującymi chromatynę.

8. OŚWIADCZENIE ETYCZNE 8.1.1. Badania te zostaną przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej, odnoszącymi się do wytycznych etycznych Światowego Stowarzyszenia Medycznego (WMA) dotyczących badań medycznych z udziałem ludzi, pierwotnie opublikowanych w 1964 r., poprawionych w 2013 r. i październiku 2018 r. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Próbki zostaną pobrane po zgłoszeniu się uczestnika i podpisaniu świadomej zgody.

8.1.2. Zatwierdzenie etyczne i zgoda na udział. Badanie to zostało po raz pierwszy zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań Naukowych (REC) Wydziału Farmacji Uniwersytetu Ain Shams 9. WIELKOŚĆ PRÓBY I MOC BADANIA 9.1. Szacunkową wielkość próby obliczono za pomocą internetowego kalkulatora wielkości próbki G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, korzystając z następujących danych wejściowych: prawdopodobieństwo błędu α wynosi (0,05), moc badania (0,8). Na podstawie wcześniejszych badań przeprowadzonych przez Bian i in., 2021;Huang i in., 2021; Tan i in., 2020; Madhvan i in., 2014 [31] [12] [24] [25], które wykazały umiarkowaną do dużej wielkość efektu, do obliczenia wielkości próby wybrano umiarkowaną wielkość efektu (0,5).

Całkowita wielkość próby wyniesie 102 przypadki, liczba ta zostanie podzielona na 2 grupy w stosunku 50:50 lub w stosunku 60:40.

9.2. Projekt Studium. Retrospektywne, jednoośrodkowe badanie kontrolowane przypadkami. 9.3. Uczestnicy badania. Grupa egipskich pacjentek chorych na raka piersi zostanie zrekrutowana z Oddziału Raka Piersi Wydziału Onkologii Klinicznej Uniwersytetu Ain Shams w Kairze w Egipcie.

Grupa 1; pacjenci ze złośliwym rakiem piersi bez przerzutów; pacjentek z nowo zdiagnozowanym rakiem piersi.

Grupa 2; grupa kontrolna; zdrowych ochotników. 9.3.1 Kliniczno-patologiczne Kryteria. Dane kliniczne uzyskane z dokumentacji medycznej i oryginalnych raportów patologicznych. Dane te należy zestawić w szczegółowym pliku Excel.

Następujące dane kliniczne należy zapisać i ocenić zgodnie z załączonym plikiem Excel.

• Pełna historia rodziny zostanie zarejestrowana w przypadku wszystkich pacjentów chorych na raka piersi.
• Indywidualna historia raka i ocena kliniczna nowotworu przeprowadzona przy użyciu klasyfikacji (TNM) Amerykańskiego Wspólnego Komitetu ds. Raka (AJCC).
• Do oceny histologicznej zostanie użyta skala Blooma-Richardsona.
• Charakterystyka chorych na raka piersi pod kątem wskaźnika masy ciała (BMI), CBC, stanu menopauzalnego, typów histopatologicznych raka piersi; inwazyjny rak przewodowy (IDC) i inwazyjny rak zrazikowy (ILC). Klasyfikacja molekularna raka piersi luminalnego A, B, potrójnie ujemnego raka piersi.
• Dane dotyczące wielkości guza oraz biomarkerów kliniczno-patologicznych CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 lub PCNA (jeśli występują) zostaną zebrane z dokumentacji pacjenta w celu dalszych korelacji i analizy statystycznej.

9.3.2. kryteria włączenia; Egipcjanki chore na raka piersi w wieku 18 lat i starsze, ze świeżo zdiagnozowanym rakiem piersi.

9.3.3 kryteria wykluczenia; choroby krwi, każdy nowotwór inny niż rak piersi, marskość wątroby oraz choroby macicy i pęcherza moczowego, a także pacjenci z rakiem piersi, u których występują przerzuty odległe.

9.4. Pobieranie krwi: 6 ml krwi obwodowej zostanie pobrane do próżniowych pojemników z żelem polimerowym z aktywatorem krzepnięcia (Greiner Bio-One GmbH, Australia) i pozostawionych na 15 minut. w temperaturze pokojowej do skrzepnięcia, a następnie 10 min. po wirowaniu przy 10 000 g w temperaturze 4°C otrzymane surowice zostaną podzielone na porcje do 5 czystych probówek Eppendorfa i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu oceny biochemicznej na Wydziale Biochemii Wydziału Farmacji Uniwersytetu Ain-Shams.

9.4.1 Przechowywane surowice zostaną wykorzystane do pomiarów poziomów docelowych białek techniką ELISA, przy użyciu dostępnych na rynku zestawów ELISA, zgodnie z instrukcjami producenta.

9.4.2. Wyekstrahowany zostanie genomowy RNA; Ekstrakcja ncRNA z próbek surowicy i ocena oczyszczania. Kwantyfikacja poziomu ekspresji ncRNA przy użyciu qRT-PCR w kroku pierwszym plus. Kontynuujemy ekstrakcję całkowitego RNA z próbki surowicy przy użyciu zestawu miRNeasy Mini Kit. Synteza c-DNA zostanie następnie przeprowadzona przy użyciu zestawu do syntezy c-DNA VERSO (Thermo Scientific, USA).

Następnie przeprowadzimy ilościowe analizy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) przy użyciu mieszanki master mix sybr green PCR (Thermo Scientific, USA) i specyficznych starterów zaprojektowanych dla docelowych ncRNA, a także genu referencyjnego metabolizmu podstawowego.

10. ANALIZA STATYSTYCZNA 10.1. Dane zostaną zebrane, tabelaryczne w Excelu, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) wersja 20, będzie używanym programem lub Stat4 lub Graphpad Prism dla rysunków, 10.3. Dane zostaną sprawdzone pod kątem normalności za pomocą kalkulatora Shapiro-Wilka, 10.3.1. Zmienne o rozkładzie normalnym należy wyrażać jako średnią + (S.E.M) i analizować przy użyciu dwóch niezależnych próbek. Test t-Studenta i ANOVA należy stosować do porównania 2 lub więcej grup, odpowiednio, jeśli rozkład normalny.

10.3.2. Dopasowanie i normalizacja czynników zakłócających, takich jak wiek i BMI, pomiędzy grupą kontrolną a pacjentami, a także analiza regresji wielokrotnej lub ANCOVA w celu przewidzenia czynnika zakłócającego, 10.3.3. Dane przedstawiane jako mediana (zakres), jeśli nie mają rozkładu normalnego, Manna-Whitneya (U) lub Kruskala-Wallisa (H), zostaną przeprowadzone w celu porównania pomiędzy, odpowiednio, dowolnymi dwiema lub większą liczbą niezależnych grup, 10.4. Wartości P były dwustronne i uznane za istotne, jeśli P <0,05,11.