"Å studere rollen til sentrale epigenetiske formidlere hos brystkreftpasienter"

Brystkreft regnes som en av de hyppigste maligne sykdommer hos kvinner over hele verden og en av de viktigste dødsårsakene blant kvinner globalt. Selv med bemerkelsesverdige fremskritt innen diagnose og terapi, forblir prognosen for brystkreftpasienter skuffende[1][2]. Brystkreft er en svært heterogen sykdom som er klassifisert i fire undertyper basert på uttrykket av visse hormonelle reseptorer som østrogenreseptor ER, progesteronreseptor PR og human epidermal vekstfaktorreseptor HER2[2]. Følgende er de fire undertypene av brystkreft: Luminal A-svulster er karakterisert ved tilstedeværelse av ER og/eller PR og fravær av HER2, Luminal B-svulster er av høyere grad og dårligere prognose sammenlignet med Luminal A, de er ER-positive og kan være PR-negativ og ha et høyt uttrykk for Ki67 (større enn 20 %), den HER2-positive gruppen utgjør 10-15 % av brystkrefttilfellene og kjennetegnes av høyt HER2-ekspresjon med fravær av ER og PR og trippel-negativ brystkreft som mangler ekspresjonen av de tre foregående reseptorene[3][4].

Epigenetisk regulering av genuttrykk er endringen i genuttrykksfunksjonen uten å endre nukleotidsekvensen. Både aktivering og inaktivering av kreftassosierte gener kan skje ved epigenetiske mekanismer. De viktigste aktørene i epigenetiske mekanismer for genregulering er DNA-metylering, histonmodifikasjon, kromatinremodellere og ikke-kodende RNA-ekspresjon [5].

Histonmodifikasjoner er en av de viktige regulatorene av kromatinstrukturen som er svært avgjørende for genuttrykk da den definerer tilgjengeligheten av DNA for transkripsjonelle regulatorer, påvirker genuttrykk og påvirker vitale cellulære prosesser [6].

Histonmodifikasjoner kan rekruttere transkripsjonsfaktorer, kromatinremodellerere og kromatinstrukturelle proteiner, så bidra til dannelse og vedlikehold av aktiv eller undertrykkende kromatintilstand [6]. De viktigste histonmodifikasjonene er: lysinacetylering, lysin- og argininmetylering, serin/treonin/tyrosin-fosforylering og serin/treonin ubiquitylering [6]. Mange av histonmodifikasjonsenzymer er ofte mutert i forskjellige typer kreft, for eksempel: EHMT2 (G9A) koder for en metyltransferase som metylerer lysinrester av histon H3, metylering av H3 ved lysin 9 av dette proteinet resulterer i rekruttering av ytterligere epigenetiske regulatorer og undertrykkelse av transkripsjon. Histonmetyltransferase G9a er godt dokumentert for sin implikasjon i neoplastisk vekst [7]. Et annet eksempel på histonmodifikasjonsenzymer er KMT5B (SUV420H1) et metyltransferaseenzym som katalyserer avsetningen av H4k20me-merket, et undertrykkende merke og antas å ha en tumorundertrykkende rolle i mange krefttyper [8].

Kromatinstrukturen kan også reguleres av kromatinremodellerers komplekser, de er fire konserverte familier av ATP-avhengige kromatinremodellere hos pattedyr (CHD), (ISWI), (INO80) og (SWI/SNF), og er involvert i de fleste essensielle celleprosesser [9].

Kromatinmodifikasjonsmaskineri er sterkt dysregulert i kreftformer inkludert brystkreft, for eksempel: mutasjoner eller inaktivering av gener som koder for underenheter av SWI/SNF-komplekset finnes i omtrent 20 % av krefttilfellene [10].

En annen viktig epigenetisk mekanisme er effekten av ikke-kodende RNA på genuttrykk.

Ikke-kodende RNA (ncRNA) er en heterogen gruppe av transkripsjoner som ikke blir oversatt til proteiner. De har dukket opp som viktige regulatorer av flere biologiske funksjoner, og deres dysregulering har vært involvert i sykdommer inkludert kreft. De har fått en enorm interesse blant det vitenskapelige miljøet på grunn av deres bruk som sykdomsbiomarkører. Det finnes mange typer ncRNA inkludert miRNA og lncRNA [11].

MikroRNA (miRNA) er små, svært konserverte ikke-kodende RNA-molekyler (18-25) nukleotider involvert i reguleringen av genuttrykk. Akkumulerende studier har identifisert at mikroRNA (miRNA) er nye regulatorer som fungerer som tumorsuppressorer eller onkogener i tumorprogresjon [12]. Det ble rapportert at exosomal miR-138-5p utøver en onkogen funksjon hos brystkreftpasienter via inhibering av KDM6B-protein [13]. Peng Bian MD et al rapporterte at uttrykket av miR-4306 ble rapportert å være nedregulert i brystkreftvev sammenlignet med tilstøtende vev [14].

Lange ikke-kodende RNA-er (lncRNA-er) er en annen type ikke-kodende RNA-er som er mer enn 200 nukleotider lange og de fleste av dem er ikke oversatt til proteiner [15]. Til tross for at de fleste lncRNA-er ikke er oversatt, har de fått stor interesse for forskning på grunn av deres regulatoriske funksjoner på genuttrykk av andre målgener [15]. LncRNA regulerer genuttrykk på epigenetiske, transkripsjonelle, post-transkripsjonelle, translasjonelle og post-translasjonelle nivåer ved å interagere med mRNA, DNA, protein og miRNA [16]. I tillegg har de en avgjørende rolle i å opprettholde biologiske prosesser som histonmodifikasjon, kromatinremodellering, transkripsjonsinterferens, transkripsjonell aktivering, mRNA-translasjon og RNA-behandling [16]. Nylig ble det uttalt at lncRNA er involvert i mange kreftformer som lungekreft, leverkreft, prostatakreft, blærekreft og brystkreft[2], så de kan brukes som en ny biomarkør og farmasøytisk mål i kreftterapi [17]. For eksempel fremmer det onkogene lncRNA PVT1 spredningen av brystkreftceller via miR-181a-2-3p/ESR1-aksen [18]. Viktigere er at lncRNA-er kan ha en krysstale med kromatinmodifiserende og remodellerende komplekser for å tett regulere mange normale cellulære veier så vel som kreftfremkallende veier. De kan regulere kromatinmodifikasjonsmaskineriet enten ved direkte interaksjon eller indirekte via sponging av visse miRNA-er. Eksempel på direkte interaksjon i kreft: LncRNA UCA1 regulerer kromatinremodellering via binding med SMARCA4 for å svekke bindingen til regionen på p21-promoteren som fører til spredning av blærekreft[19]. Eksempel på indirekte interaksjon ved kreft: LncRNA-MIAT fremmer progresjon av skjoldbruskkjertelkreft og fungerer som ceRNA for å målrette EZH2 ved å sponge miR-150-5p[20].

LncRNA kan påvises i plasma/serum og fungerer som ikke-invasiv biomarkør[21].

LncRNA UPK1A-AS1 er en nylig identifisert biomarkør i kreft. Det ble rapportert at det har en onkogen rolle i kreft i bukspyttkjertelen ved å gi platinaresistens gjennom reparasjon av dobbelttrådbrudd [22]. Dessuten ble det uttalt at UPK1A-AS1 fremmet spredningen av HCC ved å samhandle med EZH2 [23]. Til tross for at lncRNA UPK1A-AS1 ble rapportert å være onkogen i HCC-, bukspyttkjertelkreft- og lungekreftcellelinjer, ble det antatt at det har en tumorundertrykkende rolle i esophageal plateepitelkarsinomcellekreft via sponging miR-1248[24][24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 har blitt anerkjent som et onkogen i skjoldbruskkjertelkreft, prostatakreft og HCC [26] [27]. Det ble også uttalt at det har en onkogen rolle i eggstokkreft via regulering av histonmodifikasjon [28].

Rollen til lncRNAs UPK1A-AS1 og UNC5B-AS1 i patogenesen til brystkreftpasienter har imidlertid ikke blitt avslørt ennå.

1.2. Problemdefinisjon. I Egypt er brystkreft den vanligste maligniteten blant kvinner, og de fleste tilfellene blir diagnostisert på et sent stadium med dårlig prognose[29]. Omtrent 46 000 hendelsestilfeller er spådd i 2050. Selv om forekomsten i Egypt er lavere enn de globale tallene, er dødeligheten mye høyere sammenlignet med de utviklede landene med omtrent 2 ganger (41 % mot 23 %) [30]. Så å gi nye markører for brystkreftdiagnose og/eller prognose, samt å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for deres sammenheng med karsinogenese, er fortsatt en utfordring i håndtering og behandling av brystkreft.

1.3. Hypotese. Som problemformuleringen er å gi nye markører som ikke har blitt studert hos brystkreftpasienter før for å hjelpe til med diagnosen og prognosen for denne aggressive sykdommen. Følgelig vil vi i denne studien undersøke rollen til lange ikke-kodende RNA UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 som mulige diagnostiske og/eller prognostiske markører i brystkreft. I tillegg vil mulig krysstale og korrelasjon mellom disse lange ikke-kodende RNA-ene og kromatinmodifikasjonsenzymer og/eller remodelleringskomplekser som KMT5B og G9A via sponging av visse mål-miRNA-er som mir-138-5p og mir-4306 bli undersøkt. 2. TIDLIGERE STUDIER FUNN 2.1. Zhang et al. rapporterte at: UPK1A-AS1 fremmer HCC-utvikling ved å akselerere cellesyklusprogresjon gjennom interaksjon med EZH2 og sponging av miR-138-5p[23].

2.2. Wang et al. rapporterte at: UNC5B-AS1 fremmet eggstokkreftprogresjon ved å regulere H3K27me på NDRG2 via EZH2[28].

2.3. Hauang et al. rapporterte at: UNC5B-AS1 fremmer spredning, migrasjon og EMT av hepatocellulære karsinomceller via regulering av miR-4306/KDM2A-aksen [26].

3. MÅL MED ARBEIDET Å estimere ekspresjonsnivåene til våre kandidat-lncRNA-er UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 og korrelere det med ulike kliniske parametere hos brystkreftpasienter og belyse deres mulige krysstale med kromatinmodifiserende og/eller remodellerende proteiner som KMT5B og G9A hos brystkreftpasienter via sponging av visse mål-miRNA-er som mir-138-5p og mir-4306.

4. FORSKNINGSMÅL 4.1. Mål lncRNA UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 og deres mål miRNAs genuttrykk i serumprøver (væskebiopsi) og/eller vevsprøver fra brystkreftpasienter, ved bruk av kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjonsteknikk (qRT-PCR).

4.2. Mål serum- og/eller vevsmålproteinnivå ved ELISA. 4.3. Sammenlign disse ncRNA-ekspresjonsnivåene med de klassiske proteintumormarkørene, 4.4. Korreler disse ncRNA-ene og målproteinnivåaksen til de klinikopatologiske egenskapene til brystkreft som tumorstadium og -grad, tumorprogresjon (TNM) og andre klassiske klinisk-patologiske prognostiske biomarkører som karsinoembryonalt antigen (CEA), kreftantigen 15-3 (CA15-3) ), (ER), (PR), human epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2/neu), spredningsmarkøren Ki-67 eller PCNA og fullstendig blodtelling (CBC), BMI, BP, blodsukkernivå og insulin.

5. FORSKNINGSRESULTAT 5.1. Primær. Belyse rollen til våre kandidat-lncRNA-er og deres nedstrømsmål oppnådd fra brystkreftpasienters flytende biopsi og/eller vevsprøver.

5.2. Publikasjon(er)/Synlighetsresultat. Gjennomgangsartikkel + en internasjonal Scopus Q1-publikasjon som tar for seg resultater funnet + presenterer funn(er) på en internasjonal konferanse med høyt omdømme.

6. FORSKNINGS BETYDNING 6.1. Så vidt vi vet, er dette det første forskningsarbeidet som måler ekspresjonsnivået til UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 i kliniske prøver av brystkreft.

6.2. Disse dataene kan gi en lovende tilnærming for å introdusere nye markører som hjelper til med diagnostisering og prognose av brystkreft og gir et potensielt mål for genterapi.

7. FORSKNINGSMETODIKK 7.1. Bioinformatikkanalyse 7.1.1. Undersøker vår kandidat-lncRNA-uttrykk i brystkreftprøver fra genekspresjonsprofileringsinteraktiv analyse (GEPIA) basert på data fra The Cancer Genome Atlas-data (TCGA).

7.1.2. Undersøke mål-miRNA-er ved hjelp av bioinformatikkverktøy og/eller eksperimentelle studier ved å bruke den elektroniske programvaren miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Undersøkelse av utvalgte miRNA-målgener via miRNA-nettverktøy: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase eller ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ og målskanning: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Pathway-analyse eller Gene Ontology for liste over målgener via enrichr-database, listen over målgener ble analysert for deres forhold til kromatinmodifiserende og/eller remodellerende proteiner.

8. ETISK ERKLÆRING 8.1.1. Denne forskningen vil bli utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Helsinki-erklæringen med henvisning til World Medical Associations (WMA) etiske retningslinjer for medisinsk forskning med mennesker, opprinnelig publisert i 1964, revidert i 2013 og oktober 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Prøver vil bli samlet inn etter deltakerens kunngjøring og undertegning av informert samtykke.

8.1.2. Etisk godkjenning og samtykke til å delta. Denne studien ble først godkjent av forskningsetisk komité (REC) ved Det farmasøytiske fakultet, Ain Shams University 9. PRØVESTØRRELSE OG STUDIEKRAFTEN 9.1. Estimert prøvestørrelse ble beregnet ved hjelp av G power* prøvestørrelse online kalkulator http://www.gpower.hhu.de/en.html, ved å bruke følgende inndata: α feilsannsynlighet er (0,05), studiekraften (0,8). Basert på de tidligere studiene utført av Bian et al, 2021 ;Huang et al, 2021; Tan et al, 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25] som viste moderat til høy effektstørrelse, en moderat effektstørrelse (0,5) ble valgt for å beregne prøvestørrelsen.

Samlet utvalgsstørrelse vil være 102 tilfeller, dette tallet vil bli delt inn i 2 grupper enten etter forhold 50:50 eller etter forhold 60:40.

9.2. Studiedesign. Kasuskontrollert, retrospektiv, monosenterstudie. 9.3. Studiedeltakere. En serie egyptiske kvinnelige brystkreftpasienter vil bli rekruttert fra brystkreftenheten, klinisk onkologisk avdeling, Ain Shams University, Kairo, Egypt.

Gruppe 1; ondartede ikke-metastaserende brystkreftpasienter; nydiagnostiserte brystkreftpasienter.

Gruppe 2; kontrollgruppe; friske frivillige. 9.3.1 Klinisk-patologisk Kriterier. Kliniske data hentet fra medisinske journaler og de originale patologirapportene. Disse dataene skal kompileres i en detaljert Excel-fil.

Følgende kliniske data skal registreres og vurderes som i den vedlagte excel-filen.

• Full familiehistorie vil bli registrert for alle brystkreftdeltakere.
• Individuell krefthistorie og den kliniske tumorvurderingen gjort ved å bruke (TNM) klassifiseringen til American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Bloom-Richardson-skalaen vil bli brukt til histologisk gradering.
• Karakteristikkene til brystkreftpasientene med hensyn til kroppsmasseindeks (BMI), CBC, menopausal status, brystkreft histopatologiske typer; invasivt duktalt karsinom (IDC) og invasivt lobulært karsinom (ILC). Brystkreft molekylære klassifikasjoner luminal A, B, trippel negativ brystkreft.
• Tumorstørrelse, samt klinisk-patologiske biomarkører CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 eller PCNA (hvis noen) data vil bli samlet inn fra pasientfiler for ytterligere korrelasjoner og statistisk analyse.

9.3.2. Inkluderingskriterier; Egyptiske kvinner med brystkreftpasienter i alderen 18 år og oppover, nylig diagnostisert med brystkreft.

9.3.3 Eksklusjonskriterier; blodsykdommer, annen kreft enn brystkreft, levercirrhose og livmor- og urinblæresykdommer eller brystkreftpasienter med tegn på fjernmetastaser.

9.4. Blodprøvetaking: 6 ml perifert blod vil bli samlet inn i polymergelvakutainere med koagelaktivator (Greiner Bio-One GmbH, Australia), som får stå i 15 minutter. ved romtemperatur for å koagulere, etterfulgt av en 10 min. sentrifugering ved 10 000 g ved 4 °C, oppnådde sera vil bli delt opp i 5 rene Eppendorf-rør og lagret ved -80 °C, frem til biokjemisk vurdering ved biokjemisk avdeling, farmasøytisk fakultet, Ain-Shams University.

9.4.1 Lagrede sera vil bli brukt til ELISA-teknikkmålinger av målproteinnivåer, ved bruk av kommersielt tilgjengelige ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner.

9.4.2. Genomisk RNA vil bli ekstrahert; ncRNA-ekstraksjon fra serumprøver og renseevaluering. kvantifisering av ncRNAs ekspresjonsnivå, ved bruk av qRT-PCR ved trinn én pluss. Vi vil fortsette med total RNA-ekstraksjon fra serumprøve ved å bruke miRNeasy Mini Kit. c-DNA-syntesen vil bli gjort etterpå ved hjelp av VERSO c-DNA-syntesesett (Thermo Scientific, USA).

Deretter vil vi utføre kvantitative sanntids PCR (qRT-PCR) analyser ved å bruke sybr green PCR master mix (Thermo Scientific, USA) og spesifikke primere designet for mål-ncRNA-ene samt husholdningsreferansegenet.

10. STATISTISK ANALYSE 10.1. Data vil bli samlet inn, excel-tabeller, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) versjon 20, vil være det brukte programmet eller Stat4 eller Graphpad Prism for figurer, 10.3. Data vil bli testet for normalitet av Shapiro-Wilk-kalkulatoren, 10.3.1. Normalfordelte variabler skal uttrykkes som gjennomsnitt+(S.E.M) og analyseres ved hjelp av to utvalg uavhengige studenters t-test og ANOVA skal brukes for sammenligning av henholdsvis 2 eller flere grupper, hvis normalfordelte.

10.3.2. Justering og normalisering for confoundere som alder og BMI, .. mellom kontroll og pasienter samt multippel regresjonsanalyse eller ANCOVA for å forutsi en confounder, 10.3.3. Data som skal presenteres som median (område), hvis ikke normalfordelt, vil Mann-Whitney (U) eller Kruskal-Wallis (H) bli utført for å sammenligne mellom to eller flere uavhengige grupper, henholdsvis, 10.4. P-verdier var tosidet og ansett som signifikante hvis P <0.05.11.