"Studio del ruolo dei principali mediatori epigenetici nelle pazienti affette da cancro al seno"

Il cancro al seno è considerato una delle neoplasie più frequenti nelle donne in tutto il mondo e una delle principali cause di morte tra le donne a livello globale. Nonostante i notevoli progressi nella diagnosi e nella terapia, la prognosi delle pazienti affette da cancro al seno rimane deludente[1][2]. Il cancro al seno è una malattia altamente eterogenea classificata in quattro sottotipi in base all’espressione di alcuni recettori ormonali come il recettore degli estrogeni ER, il recettore del progesterone PR e il recettore del fattore di crescita epidermico umano HER2[2]. Di seguito sono riportati i quattro sottotipi di cancro al seno: i tumori luminali A sono caratterizzati dalla presenza di ER e/o PR e l'assenza di HER2, i tumori luminali B sono di grado più elevato e con prognosi peggiore rispetto ai luminali A, sono ER positivi e può essere PR negativo e avere un'elevata espressione di Ki67 (maggiore del 20%), il gruppo HER2-positivo costituisce il 10-15% dei tumori al seno ed è caratterizzato da un'elevata espressione di HER2 con assenza di ER e cancro al seno PR e triplo negativo a cui manca l'espressione dei tre recettori precedenti [3] [4].

La regolazione epigenetica dell'espressione genica è l'alterazione della funzione dell'espressione genica senza modificare la sequenza nucleotidica. Sia l’attivazione che l’inattivazione dei geni associati al cancro possono avvenire mediante meccanismi epigenetici. I principali attori nei meccanismi epigenetici della regolazione genetica sono la metilazione del DNA, la modificazione degli istoni, i rimodellatori della cromatina e l'espressione dell'RNA non codificante[5].

Le modifiche degli istoni sono uno degli importanti regolatori della struttura della cromatina che è molto cruciale per l'espressione genica poiché definisce l'accessibilità del DNA per i regolatori trascrizionali, influenza l'espressione genica e influenza i processi cellulari vitali [6].

Le modifiche degli istoni possono reclutare fattori di trascrizione, rimodellatori della cromatina e proteine ​​strutturali della cromatina, contribuendo così alla formazione e al mantenimento dello stato della cromatina attivo o repressivo[6]. Le modificazioni più importanti degli istoni sono: acetilazione della lisina, metilazione della lisina e dell'arginina, fosforilazione della serina/treonina/tirosina e ubiquitilazione della serina/treonina [6]. Molti degli enzimi di modificazione degli istoni sono frequentemente mutati in diversi tipi di cancro, ad esempio: EHMT2 (G9A) codifica una metiltransferasi che metila i residui di lisina dell'istone H3, La metilazione di H3 nella lisina 9 da parte di questa proteina comporta il reclutamento di ulteriori regolatori epigenetici e la repressione di trascrizione. L'istone metiltransferasi G9a è ben documentato per il suo coinvolgimento nella crescita neoplastica[7]. Un altro esempio di enzimi di modificazione dell'istone è KMT5B (SUV420H1), un enzima metiltransferasi che catalizza la deposizione del marchio H4k20me, un marchio repressivo e si ritiene che abbia un ruolo di soppressore del tumore in molti tipi di cancro[8].

La struttura della cromatina può anche essere regolata dai complessi dei rimodellatori della cromatina, che sono quattro famiglie conservate di rimodellatori della cromatina ATP-dipendenti nei mammiferi (CHD), (ISWI), (INO80) e (SWI/SNF) e sono coinvolti nella maggior parte dei casi. processi cellulari essenziali [9].

Il meccanismo di modificazione della cromatina è altamente disregolato nei tumori, incluso il cancro al seno, ad esempio: mutazioni o inattivazione dei geni che codificano le subunità del complesso SWI/SNF si riscontrano in circa il 20% dei tumori[10].

Un altro importante meccanismo epigenetico è l’effetto degli RNA non codificanti sull’espressione genica.

Gli RNA non codificanti (ncRNA) sono un gruppo eterogeneo di trascritti che non vengono tradotti in proteine. Sono emersi come importanti regolatori di molteplici funzioni biologiche e la loro disregolazione è stata implicata in malattie tra cui il cancro. Hanno suscitato un enorme interesse nella comunità scientifica grazie al loro utilizzo come biomarcatori di malattie. Esistono molti tipi di ncRNA inclusi miRNA e lncRNA[11].

I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA non codificanti (18-25) altamente conservate coinvolte nella regolazione dell'espressione genica. Numerosi studi hanno identificato che i microRNA (miRNA) sono nuovi regolatori che agiscono come soppressori tumorali o oncogeni nella progressione del tumore[12]. È stato riportato che il miR-138-5p esosomiale esercita una funzione oncogena nei pazienti affetti da cancro al seno attraverso l'inibizione della proteina KDM6B[13]. Peng Bian MD et al hanno riferito che l'espressione di miR-4306 risulta sottoregolata nei tessuti del cancro al seno rispetto ai tessuti adiacenti[14].

Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) sono un altro tipo di RNA non codificanti che sono lunghi più di 200 nucleotidi e la maggior parte di essi non viene tradotta in proteine[15]. Nonostante la maggior parte degli lncRNA non siano tradotti, hanno guadagnato un enorme interesse nella ricerca a causa delle loro funzioni regolatrici sull'espressione genica di altri geni bersaglio[15]. Gli LncRNA regolano l'espressione genica a livello epigenetico, trascrizionale, post-trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale interagendo con mRNA, DNA, proteine ​​e miRNA[16]. Inoltre, hanno un ruolo cruciale nel mantenimento dei processi biologici come la modificazione degli istoni, il rimodellamento della cromatina, l'interferenza trascrizionale, l'attivazione trascrizionale, la traduzione dell'mRNA e l'elaborazione dell'RNA[16]. Recentemente è stato affermato che gli lncRNA sono coinvolti in molti tumori come il cancro al polmone, il cancro al fegato, il cancro alla prostata, il cancro alla vescica e il cancro al seno[2], quindi possono essere utilizzati come nuovo biomarcatore e bersaglio farmaceutico nella terapia del cancro [17]. Ad esempio, l’oncogeno lncRNA PVT1 promuove la proliferazione delle cellule del cancro al seno tramite l’asse miR-181a-2-3p/ESR1 [18]. È importante sottolineare che gli lncRNA possono interagire con i complessi di modificazione e rimodellamento della cromatina per regolare strettamente molti percorsi cellulari normali e percorsi cancerogeni. Possono regolare il meccanismo di modificazione della cromatina sia mediante interazione diretta che indirettamente tramite spugnatura di determinati miRNA. Esempio di interazione diretta nel cancro: LncRNA UCA1 regola il rimodellamento della cromatina attraverso il legame con SMARCA4 per compromettere il suo legame con la sua regione sul promotore p21 che porta alla proliferazione del cancro della vescica[19]. Esempio di interazione indiretta nel cancro: LncRNA-MIAT promuove la progressione del cancro alla tiroide e funziona come ceRNA per colpire EZH2 mediante spugnatura di miR-150-5p[20].

Gli LncRNA possono essere rilevati nel plasma/siero e quindi funzionano come biomarcatori non invasivi[21].

LncRNA UPK1A-AS1 è un biomarcatore recentemente identificato nel cancro. È stato riferito che ha un ruolo oncogenico nel cancro del pancreas conferendo resistenza al platino attraverso la riparazione della rottura del doppio filamento[22]. Inoltre, è stato affermato che UPK1A-AS1 promuove la proliferazione dell'HCC interagendo con EZH2[23]. Nonostante il fatto che lncRNA UPK1A-AS1 sia risultato oncogenico nelle linee cellulari di HCC, cancro del pancreas e cancro del polmone, si credeva che avesse un ruolo di soppressore del tumore nel cancro delle cellule di carcinoma a cellule squamose dell'esofago attraverso la spugnatura di miR-1248[24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 è stato riconosciuto come un oncogene nel cancro della tiroide, nel cancro alla prostata e nell'HCC[26] [27]. È stato inoltre affermato che ha un ruolo oncogenico nel cancro ovarico regolando la modificazione degli istoni[28].

Tuttavia, il ruolo degli lncRNA UPK1A-AS1 e UNC5B-AS1 nella patogenesi dei pazienti affetti da cancro al seno non è stato ancora rivelato.

1.2. Definizione del problema. In Egitto, il cancro al seno è la neoplasia maligna più comune tra le donne e la maggior parte dei casi viene diagnosticata in fase avanzata con prognosi infausta[29]. Nel 2050 si prevedono circa 46.000 casi incidenti. Sebbene il tasso di incidenza in Egitto sia inferiore a quello globale, il tasso di mortalità è molto più elevato rispetto ai paesi sviluppati di circa 2 volte (41% contro 23%) [30]. Pertanto, fornire nuovi marcatori per la diagnosi e/o la prognosi del cancro al seno, nonché comprendere i meccanismi molecolari alla base del loro legame con la carcinogenesi, rimane una sfida nella gestione e nel trattamento del cancro al seno.

1.3. Ipotesi. Poiché il problema è quello di fornire nuovi marcatori che non sono stati studiati prima in pazienti affetti da cancro al seno, per aiutare nella diagnosi e nella prognosi di questa malattia aggressiva. Di conseguenza, nel presente studio investigheremo il ruolo degli RNA lunghi non codificanti UPK1A-AS1 e/o UNC5B-AS1 come possibili marcatori diagnostici e/o prognostici nel cancro al seno. Inoltre, verrà studiata la possibile diafonia e la correlazione tra questi lunghi RNA non codificanti e gli enzimi di modificazione della cromatina e/o complessi di rimodellamento come KMT5B e G9A attraverso la spugnatura di alcuni miRNA target come mir-138-5p e mir-4306. 2. RISULTATI DI STUDI PRECEDENTI 2.1. Zhang et al. hanno riferito che: UPK1A-AS1 promuove lo sviluppo dell'HCC accelerando la progressione del ciclo cellulare attraverso l'interazione con EZH2 e la spugnatura di miR-138-5p[23].

2.2. Wang et al. ha riferito che: UNC5B-AS1 ha promosso la progressione del cancro ovarico regolando l'H3K27me su NDRG2 tramite EZH2[28].

2.3. Hauang et al. hanno riferito che: UNC5B-AS1 promuove la proliferazione, la migrazione e l'EMT delle cellule di carcinoma epatocellulare attraverso la regolazione dell'asse miR-4306/KDM2A[26].

3. SCOPO DEL LAVORO Stimare i livelli di espressione dei nostri lncRNA candidati UPK1A-AS1 e/o UNC5B-AS1 e correlarli con diversi parametri clinici in pazienti con cancro al seno e far luce sulla loro possibile diafonia con proteine ​​che modificano e/o rimodellano la cromatina come KMT5B e G9A nei pazienti affetti da cancro al seno attraverso la spugnatura di alcuni miRNA target come mir-138-5p e mir-4306.

4. OBIETTIVO(I) DI RICERCA 4.1. Misurare l'espressione genica dell'lncRNA UPK1A-AS1 e/o UNC5B-AS1 e dei relativi miRNA target in campioni di siero (biopsia liquida) e/o campioni di tessuto di pazienti affetti da cancro al seno, utilizzando la tecnica quantitativa di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR).

4.2. Misurare il livello delle proteine ​​bersaglio nel siero e/o nei tessuti mediante ELISA. 4.3. Confrontare il livello di espressione di questi ncRNA con i classici marcatori tumorali proteici, 4.4. Correlare questi ncRNA e l'asse del livello della proteina bersaglio con le caratteristiche clinicopatologiche del cancro al seno come stadio e grado del tumore, progressione del tumore (TNM) e altri biomarcatori prognostici clinicopatologici classici come l'antigene carcinoembrionario (CEA), l'antigene del cancro 15-3 (CA15-3 ), (ER), (PR), recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2/neu), il marcatore di proliferazione Ki-67 o PCNA ed emocromo completo (CBC), BMI, PA, livello di glucosio nel sangue e insulina.

5. RISULTATI DELLA RICERCA 5.1. Primario. Chiarire il ruolo dei nostri lncRNA candidati e i loro bersagli a valle ottenuti dalla biopsia liquida e/o dai campioni di tessuto di pazienti con cancro al seno.

5.2. Esito pubblicazione/i/visibilità. Articolo di revisione + una pubblicazione internazionale Scopus Q1 che affronta i risultati trovati + presentazione dei risultati in una conferenza internazionale di alta reputazione.

6. IMPORTANZA DELLA RICERCA 6.1. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo lavoro di ricerca che misura il livello di espressione di UPK1A-AS1 e/o UNC5B-AS1 in campioni clinici di cancro al seno.

6.2. Questi dati potrebbero fornire un approccio promettente per l’introduzione di nuovi marcatori che aiutino nella diagnosi e nella prognosi del cancro al seno e forniscano potenziali bersagli per la terapia genica.

7. METODOLOGIA DI RICERCA 7.1. Analisi Bioinformatica 7.1.1. Studio dell'espressione degli lncRNA candidati in campioni di cancro al seno mediante analisi interattiva del profilo di espressione genica (GEPIA) sulla base dei dati del Cancer Genome Atlas (TCGA).

7.1.2. Indagare i miRNA target mediante strumenti bioinformatici e/o studi sperimentali utilizzando il software online miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Investigando i miRNA selezionati sui geni target tramite strumenti online miRNA: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase o ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ e scansione del target: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Analisi del percorso o ontologia genetica per l'elenco dei geni bersaglio tramite database arricchitore, l'elenco dei geni bersaglio è stato analizzato per la loro relazione con le proteine ​​che modificano e/o rimodellano la cromatina.

8. DICHIARAZIONE ETICA 8.1.1. Questa ricerca sarà eseguita in conformità con le linee guida stabilite dalla Dichiarazione di Helsinki che fa riferimento alle linee guida etiche della World Medical Association (WMA) per la ricerca medica con soggetti umani, originariamente pubblicate nel 1964, riviste nel 2013 e nell'ottobre 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

I campioni verranno raccolti dopo l'annuncio del partecipante e la firma del consenso informato.

8.1.2. Approvazione etica e consenso alla partecipazione. Questo studio è stato approvato per la prima volta dal Comitato Etico della Ricerca (REC) della Facoltà di Farmacia, Università di Ain Shams. 9. DIMENSIONE DEL CAMPIONE E POTENZA DELLO STUDIO 9.1. La dimensione stimata del campione è stata calcolata con il calcolatore online della dimensione del campione G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, utilizzando i seguenti dati di input: la probabilità di errore α è (0,05), il potere dello studio (0,8). Sulla base degli studi precedenti condotti da Bian et al, 2021; Huang et al,2021; Tan et al,2020; Madhvan et al,2014 [31] [12] [24] [25] che mostravano una dimensione dell'effetto da moderata ad alta, per calcolare la dimensione del campione è stata scelta una dimensione dell'effetto moderata (0,5).

La dimensione totale del campione sarà di 102 casi, questo numero sarà suddiviso in 2 gruppi per rapporto 50:50 o per rapporto 60:40.

9.2. Progettazione dello studio. Studio caso-controllo, retrospettivo, monocentrico. 9.3. Partecipanti allo studio. Una serie di pazienti egiziane con cancro al seno sarà reclutata dalla Breast Cancer Unit, Dipartimento di Oncologia Clinica, Università di Ain Shams, Il Cairo, Egitto.

Gruppo 1; pazienti affetti da cancro al seno maligno non metastatico; pazienti con tumore al seno di nuova diagnosi.

Gruppo 2; gruppo di controllo; volontari sani. 9.3.1 Clinico-patologico Criteri. Dati clinici ottenuti dalle cartelle cliniche e dai referti patologici originali. Questi dati devono essere compilati in un file Excel dettagliato.

I seguenti dati clinici da registrare e valutare come nel file excel allegato.

• La storia familiare completa sarà registrata per tutti i partecipanti al cancro al seno.
• Anamnesi individuale del cancro e valutazione clinica del tumore effettuata utilizzando la classificazione (TNM) dell'American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Per la classificazione istologica verrà utilizzata la scala Bloom-Richardson.
• Le caratteristiche delle pazienti con cancro al seno per quanto riguarda indice di massa corporea (BMI), emocromo, stato menopausale, tipi istopatologici di cancro al seno; carcinoma duttale invasivo (IDC) e carcinoma lobulare invasivo (ILC). Classificazioni molecolari del cancro al seno luminale A, B, cancro al seno triplo negativo.
• Le dimensioni del tumore, nonché i biomarcatori clinico-patologici CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 o PCNA (se presenti) verranno raccolti dai file dei pazienti per ulteriori correlazioni e analisi statistiche.

9.3.2. Criteri di inclusione; Pazienti con cancro al seno di sesso femminile egiziano di età pari o superiore a 18 anni, a cui è stato recentemente diagnosticato un cancro al seno.

9.3.3 Criteri di esclusione; malattie del sangue, qualsiasi cancro diverso dal cancro al seno, cirrosi epatica e malattie della vescica uterina e urinaria o pazienti con cancro al seno con qualsiasi evidenza di metastasi a distanza.

9.4. Prelievo di sangue: 6 ml di sangue periferico verranno raccolti in vacutainer di gel polimerico con attivatore di coagulazione (Greiner Bio-One GmbH, Australia), lasciati per 15 minuti. a temperatura ambiente per coagulare, seguito da 10 min. centrifugazione a 10.000 g a 4°C, i sieri ottenuti verranno aliquotati in 5 provette Eppendorf pulite e conservati a -80°C, fino alla valutazione biochimica presso il Dipartimento di Biochimica, Facoltà di Farmacia, Università di Ain-Shams.

9.4.1 I sieri conservati verranno utilizzati per misurazioni con tecnica ELISA dei livelli di proteine ​​bersaglio, utilizzando kit ELISA disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.

9.4.2. Verrà estratto l'RNA genomico; Estrazione di ncRNA da campioni di siero e valutazione della purificazione. Quantificazione del livello di espressione degli ncRNA, utilizzando qRT-PCR nel passaggio uno plus. Procederemo con l'estrazione dell'RNA totale dal campione di siero utilizzando miRNeasy Mini Kit. La sintesi del c-DNA verrà effettuata successivamente utilizzando il kit di sintesi del c-DNA VERSO (Thermo Scientific, USA).

Successivamente, effettueremo analisi quantitative di PCR in tempo reale (qRT-PCR) utilizzando la master mix sybr green PCR (Thermo Scientific, USA) e primer specifici progettati per gli ncRNA target e per il gene di riferimento housekeeping.

10. ANALISI STATISTICA 10.1. I dati verranno raccolti, tabulati in Excel, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) versione 20, sarà il programma utilizzato o Stat4 o Graphpad Prism per le figure, 10.3. La normalità dei dati verrà verificata mediante il calcolatore Shapiro-Wilk, 10.3.1. Le variabili normalmente distribuite devono essere espresse come media+(S.E.M) e analizzate utilizzando due campioni indipendenti. Il test t di Student e l'ANOVA devono essere utilizzati per il confronto di 2 o più gruppi, se distribuiti normalmente, rispettivamente.

10.3.2. Aggiustamento e normalizzazione per fattori di confondimento come età e BMI, .. tra controllo e pazienti, nonché analisi di regressione multipla o ANCOVA per prevedere un confondente, 10.3.3. I dati da presentare come mediana (intervallo), se non distribuiti normalmente, saranno condotti come Mann-Whitney (U) o Kruskal-Wallis (H) per confrontare rispettivamente due o più gruppi indipendenti qualsiasi, 10.4. I valori P erano a due code e considerati significativi se P <0,05,11.