"Estudando o papel dos principais mediadores epigenéticos em pacientes com câncer de mama"

O câncer de mama é considerado uma das doenças malignas mais frequentes em mulheres em todo o mundo e uma das principais causas de morte entre mulheres em todo o mundo. Mesmo com avanços notáveis ​​no diagnóstico e na terapia, o prognóstico dos pacientes com câncer de mama permanece decepcionante[1][2]. O câncer de mama é uma doença altamente heterogênea que é classificada em quatro subtipos com base na expressão de certos receptores hormonais como o receptor de estrogênio ER, o receptor de progesterona PR e o receptor do fator de crescimento epidérmico humano HER2 [2]. A seguir estão os quatro subtipos de câncer de mama: Os tumores Luminal A são caracterizados pela presença de ER e/ou PR e a ausência de HER2, os tumores Luminal B são de grau mais alto e pior prognóstico em comparação com Luminal A, são ER positivos e pode ser PR negativo e ter alta expressão de Ki67 (maior que 20%), o grupo HER2 positivo constitui 10-15% dos cânceres de mama e é caracterizado por alta expressão de HER2 com ausência de ER e PR e câncer de mama triplo-negativo que não possuem a expressão dos três receptores anteriores[3][4].

A regulação epigenética da expressão gênica é a alteração na função da expressão gênica sem alterar a sequência de nucleotídeos. Tanto a ativação quanto a inativação de genes associados ao câncer podem ocorrer por mecanismos epigenéticos. Os principais atores nos mecanismos epigenéticos de regulação gênica são metilação do DNA, modificação de histonas, remodeladores da cromatina e expressão de RNA não codificante [5].

As modificações das histonas são um dos importantes reguladores da estrutura da cromatina, que é muito crucial para a expressão gênica, pois define a acessibilidade do DNA para reguladores transcricionais, afeta a expressão gênica e influencia processos celulares vitais [6].

As modificações das histonas podem recrutar fatores de transcrição, remodeladores da cromatina e proteínas estruturais da cromatina, contribuindo assim para a formação e manutenção do estado ativo ou repressivo da cromatina [6]. As modificações mais importantes das histonas são: acetilação da lisina, metilação da lisina e arginina, fosforilação de serina / treonina / tirosina e ubiquitilação de serina / treonina [6]. Muitas das enzimas de modificação de histonas são frequentemente mutadas em diferentes tipos de câncer, por exemplo: EHMT2 (G9A) codifica uma metiltransferase que metila resíduos de lisina da histona H3, a metilação de H3 na lisina 9 por esta proteína resulta no recrutamento de reguladores epigenéticos adicionais e na repressão de transcrição. A histona metiltransferase G9a está bem documentada por sua implicação no crescimento neoplásico [7]. Outro exemplo de enzimas de modificação de histonas é a KMT5B (SUV420H1), uma enzima metil transferase que catalisa a deposição da marca H4k20me, uma marca repressiva e acredita-se que tenha um papel supressor de tumor em muitos tipos de câncer [8].

A estrutura da cromatina também pode ser regulada por complexos de remodeladores de cromatina, eles são quatro famílias conservadas de remodeladores de cromatina dependentes de ATP em mamíferos (CHD), (ISWI), (INO80) e (SWI/SNF), e estão envolvidos na maioria processos celulares essenciais [9].

A maquinaria de modificação da cromatina é altamente desregulada em cancros, incluindo o cancro da mama, por exemplo: mutações ou inactivação de genes que codificam subunidades do complexo SWI/SNF são encontradas em aproximadamente 20% dos cancros [10].

Outro importante mecanismo epigenético é o efeito dos RNAs não codificantes na expressão gênica.

RNAs não codificantes (ncRNAs) são um grupo heterogêneo de transcritos que não são traduzidos em proteínas. Eles emergiram como importantes reguladores de múltiplas funções biológicas, e sua desregulação tem sido implicada em doenças, incluindo o câncer. Eles ganharam um enorme interesse entre a comunidade científica devido ao seu uso como biomarcadores de doenças. Existem muitos tipos de ncRNAs, incluindo miRNAs e lncRNAs [11].

MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificantes (18-25) altamente conservadas, envolvidas na regulação da expressão gênica. Estudos acumulados identificaram que os microRNAs (miRNAs) são novos reguladores que atuam como supressores tumorais ou oncogenes na progressão tumoral [12]. Foi relatado que o miR-138-5p exossômico exerce uma função oncogênica em pacientes com câncer de mama através da inibição da proteína KDM6B [13]. Peng Bian MD et al relataram que a expressão de miR-4306 foi relatada como regulada negativamente em tecidos de câncer de mama se comparada a tecidos adjacentes [14].

RNAs não codificantes longos (lncRNAs) são outro tipo de RNAs não codificantes que têm mais de 200 nucleotídeos de comprimento e a maioria deles não é traduzida em proteínas [15]. Apesar de a maioria dos lncRNAs não serem traduzidos, eles ganharam enorme interesse na pesquisa devido às suas funções reguladoras na expressão gênica de outros genes alvo [15]. Os LncRNAs regulam a expressão gênica nos níveis epigenético, transcricional, pós-transcricional, translacional e pós-traducional, interagindo com mRNA, DNA, proteína e miRNA [16]. Além disso, eles têm um papel crucial na manutenção de processos biológicos como modificação de histonas, remodelamento da cromatina, interferência transcricional, ativação transcricional, tradução de mRNA e processamento de RNA [16]. Recentemente, foi afirmado que os lncRNAs estão envolvidos em muitos tipos de câncer, como câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de bexiga e câncer de mama [2], portanto, eles podem ser usados ​​como um novo biomarcador e alvo farmacêutico na terapia do câncer [17]. Por exemplo, o lncRNA oncogênico PVT1 promove a proliferação de células de câncer de mama através do eixo miR-181a-2-3p/ESR1 [18]. É importante ressaltar que os lncRNAs podem ter um crosstalk com complexos de modificação e remodelação da cromatina para regular rigorosamente muitas vias celulares normais, bem como vias carcinogênicas. Eles podem regular a maquinaria de modificação da cromatina, seja por interação direta ou indiretamente, através da esponja de certos miRNAs. Exemplo de interação direta no câncer: LncRNA UCA1 regula a remodelação da cromatina através da ligação com SMARCA4 para prejudicar sua ligação à sua região no promotor p21, o que leva à proliferação do câncer de bexiga [19]. Exemplo de interação indireta no câncer: LncRNA-MIAT promove a progressão do câncer de tireoide e funciona como ceRNA para atingir EZH2 por meio da esponja miR-150-5p [20].

Os LncRNAs podem ser detectados no plasma/soro, portanto funcionam como biomarcadores não invasivos [21].

LncRNA UPK1A-AS1 é um biomarcador recentemente identificado no câncer. Foi relatado que tem um papel oncogênico no câncer de pâncreas, conferindo resistência à platina através do reparo de quebra de fita dupla [22]. Além disso, foi afirmado que UPK1A-AS1 promoveu a proliferação de CHC ao interagir com EZH2 [23]. Apesar do fato de que o lncRNA UPK1A-AS1 foi relatado como oncogênico em linhas celulares de CHC, câncer de pâncreas e câncer de pulmão, acreditava-se que ele tem um papel supressor de tumor no câncer de células de carcinoma de células escamosas do esôfago por meio da esponja miR-1248 [24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 foi reconhecido como um oncogene no câncer de tireoide, câncer de próstata e CHC [26] [27]. Também foi afirmado que tem papel oncogênico no câncer de ovário através da regulação da modificação de histonas [28].

No entanto, o papel dos lncRNAs UPK1A-AS1 e UNC5B-AS1 na patogênese de pacientes com câncer de mama ainda não foi revelado.

1.2. Definição do problema. No Egipto, o cancro da mama é a doença maligna mais comum entre as mulheres, sendo a maioria dos casos diagnosticados numa fase tardia com mau prognóstico[29]. Aproximadamente 46.000 casos incidentes estão previstos em 2050. Embora a taxa de incidência no Egito seja inferior aos números globais, a taxa de mortalidade é muito maior se comparada com os países desenvolvidos em aproximadamente 2 vezes (41% versus 23%) [30]. Assim, fornecer novos marcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da mama, bem como compreender os mecanismos moleculares subjacentes à sua ligação com a carcinogénese, continua a ser um desafio na gestão e tratamento do cancro da mama.

1.3. Hipótese. Como a definição do problema é fornecer novos marcadores que não tenham sido estudados em pacientes com câncer de mama antes para ajudar no diagnóstico e prognóstico desta doença agressiva. Assim, no presente estudo iremos investigar o papel dos longos RNAs não codificantes UPK1A-AS1 e/ou UNC5B-AS1 como possíveis marcadores diagnósticos e/ou prognósticos no câncer de mama. Além disso, será investigada a possível interferência e correlação entre esses longos RNAs não codificantes e enzimas de modificação da cromatina e/ou complexos de remodelação como KMT5B e G9A via esponja de certos miRNAs alvo como mir-138-5p e mir-4306. 2. RESULTADOS DE ESTUDOS ANTERIORES 2.1. Zhang et al. relataram que: UPK1A-AS1 promove o desenvolvimento de CHC acelerando a progressão do ciclo celular através da interação com EZH2 e esponja de miR-138-5p [23].

2.2. Wang et al. relataram que: UNC5B-AS1 promoveu a progressão do câncer de ovário regulando o H3K27me no NDRG2 via EZH2 [28].

2.3. Hauang et al. relataram que: UNC5B-AS1 promove a proliferação, migração e EMT de células de carcinoma hepatocelular através da regulação do eixo miR-4306/KDM2A [26].

3. OBJETIVO DO TRABALHO Estimar os níveis de expressão de nossos lncRNAs candidatos UPK1A-AS1 e/ou UNC5B-AS1 e correlacioná-los com diferentes parâmetros clínicos em pacientes com câncer de mama e lançar luz sobre seu possível crosstalk com proteínas modificadoras e/ou remodeladoras da cromatina como KMT5B e G9A em pacientes com câncer de mama por meio da esponja de certos miRNAs alvo como mir-138-5p e mir-4306.

4. OBJETIVO(S) DE PESQUISA 4.1. Medir lncRNA UPK1A-AS1 e/ou UNC5B-AS1 e sua expressão gênica de miRNAs alvo em amostras de soro (biópsia líquida) e/ou amostras de tecido de pacientes com câncer de mama, usando técnica quantitativa de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR).

4.2. Medir o nível de proteínas alvo séricas e/ou teciduais, por ELISA. 4.3. Compare o nível de expressão desses ncRNAs com os marcadores tumorais proteicos clássicos, 4.4. Correlacionar esses ncRNAs e o eixo do nível de proteína alvo com as características clinicopatológicas do câncer de mama como estágio e grau do tumor, progressão tumoral (TNM) e outros biomarcadores prognósticos clinicopatológicos clássicos, como antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno de câncer 15-3 (CA15-3 ), (ER), (PR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2/neu), marcador de proliferação Ki-67 ou PCNA e hemograma completo (CBC), IMC, PA, nível de glicose no sangue e insulina.

5. RESULTADO DA PESQUISA 5.1. Primário. Elucidar o papel de nossos lncRNAs candidatos e seus alvos a jusante obtidos de biópsia líquida e/ou amostras de tecido de pacientes com câncer de mama.

5.2. Publicação(ões)/Resultado de visibilidade. Artigo de revisão + uma publicação internacional Scopus Q1 abordando os resultados encontrados + apresentando resultados em uma conferência internacional de alta reputação.

6. SIGNIFICADO DA PESQUISA 6.1. Até onde sabemos, este é o primeiro trabalho de pesquisa que mede o nível de expressão de UPK1A-AS1 e/ou UNC5B-AS1 em amostras clínicas de câncer de mama.

6.2. Estes dados podem fornecer uma abordagem promissora na introdução de novos marcadores que ajudem no diagnóstico e prognóstico do cancro da mama e forneçam alvos potenciais para a terapia genética.

7. METODOLOGIA DE PESQUISA 7.1. Análise Bioinformática 7.1.1. Investigando a expressão de nossos lncRNAs candidatos em amostras de câncer de mama a partir da análise interativa de perfil de expressão gênica (GEPIA) com base em dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA).

7.1.2. Investigando miRNAs alvo por ferramentas de bioinformática e/ou estudos experimentais usando o software online miRcode (//mircode.org/index.php).

7.1.3. Investigando genes-alvo de miRNAs selecionados por meio de ferramentas on-line de miRNA: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase ou ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ e verificação de alvo: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Análise de via ou Gene Ontology para lista de genes alvo via banco de dados enriquecedor, a lista de genes alvo foi analisada quanto à sua relação com proteínas modificadoras e/ou remodeladoras da cromatina.

8. DECLARAÇÃO ÉTICA 8.1.1. Esta pesquisa será realizada de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Declaração de Helsinque referente às diretrizes de ética da Associação Médica Mundial (WMA) para pesquisas médicas com seres humanos, publicadas originalmente em 1964, revisadas em 2013 e outubro de 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

As amostras serão coletadas após anúncio do participante e assinatura do consentimento informado.

8.1.2. Aprovação ética e consentimento para participação. Este estudo foi aprovado pela primeira vez pelo Comitê de Ética em Pesquisa (REC) da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams 9. TAMANHO DA AMOSTRA E PODER DO ESTUDO 9.1. O tamanho estimado da amostra foi calculado pela calculadora on-line de tamanho de amostra G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, usando os seguintes dados de entrada: a probabilidade de erro α é (0,05), o poder do estudo (0,8). Com base nos estudos anteriores realizados por Bian et al, 2021;Huang et al,2021; Tan et al, 2020; Madhvan et al,2014 [31] [12] [24] [25] que mostrou tamanho de efeito moderado a alto, um tamanho de efeito moderado (0,5) foi escolhido para calcular o tamanho da amostra.

O tamanho total da amostra será de 102 casos, este número será subdividido em 2 grupos pela proporção 50:50 ou pela proporção 60:40.

9.2. Projeto de estudo. Estudo caso-controlado, retrospectivo, monocêntrico. 9.3. Participantes do estudo. Uma série de pacientes egípcias com câncer de mama serão recrutadas na Unidade de Câncer de Mama, Departamento de Oncologia Clínica, Universidade Ain Shams, Cairo, Egito.

Grupo 1; pacientes com câncer de mama maligno não metastático; pacientes recém-diagnosticados com câncer de mama.

Grupo 2; grupo controle; voluntários saudáveis. 9.3.1 Clínico-patológico Critérios. Dados clínicos obtidos de prontuários médicos e relatórios patológicos originais. Esses dados devem ser compilados em um arquivo Excel detalhado.

Os seguintes dados clínicos devem ser registrados e avaliados conforme o arquivo Excel anexo.

• O histórico familiar completo será registrado para todos os participantes com câncer de mama.
• História individual de câncer e avaliação clínica do tumor feita usando a classificação (TNM) do American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• A escala Bloom-Richardson será utilizada para classificação histológica.
• As características das pacientes com câncer de mama em relação ao índice de massa corporal (IMC), hemograma completo, estado da menopausa, tipos histopatológicos de câncer de mama; carcinoma ductal invasivo (CDI) e carcinoma lobular invasivo (CLI). Classificações moleculares do câncer de mama luminal A, B, câncer de mama triplo negativo.
• O tamanho do tumor, bem como os biomarcadores clínico-patológicos CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 ou PCNA (se houver) serão coletados dos arquivos dos pacientes para futuras correlações e análises estatísticas.

9.3.2. Critérios de Inclusão; Mulheres egípcias pacientes com câncer de mama com 18 anos ou mais, recém-diagnosticadas com câncer de mama.

9.3.3 Critérios de Exclusão; doenças do sangue, qualquer câncer que não seja câncer de mama, cirrose hepática e doenças da bexiga uterina e urinária ou pacientes com câncer de mama com qualquer evidência de metástases à distância.

9.4. Amostragem de sangue: 6 ml de sangue periférico serão coletados em vacutainers de gel polimérico com ativador de coágulo (Greiner Bio-One GmbH, Austrália), deixados por 15 min. à temperatura ambiente para coagular, seguido de 10 min. centrifugação a 10.000g a 4°C, os soros obtidos serão alíquotas em 5 tubos Eppendorf limpos e armazenados a -80°C, até avaliação bioquímica no Departamento de Bioquímica da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain-Shams.

9.4.1 Os soros armazenados serão utilizados para medições da técnica ELISA dos níveis de proteína alvo, utilizando kits ELISA disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.

9.4.2. O RNA genômico será extraído; Extração de ncRNAs de amostras de soro e avaliação de purificação. Quantificação do nível de expressão de ncRNAs, usando qRT-PCR na etapa um plus. Prosseguiremos com a extração total de RNA da amostra de soro usando o miRNeasy Mini Kit. A síntese de c-DNA será feita posteriormente utilizando o kit de síntese de c-DNA VERSO (Thermo Scientific, EUA).

A seguir, realizaremos análises quantitativas de PCR em tempo real (qRT-PCR) utilizando master mix sybr green PCR (Thermo Scientific, EUA) e primers específicos projetados para os ncRNAs alvo, bem como para o gene de referência de limpeza.

10. ANÁLISE ESTATÍSTICA 10.1. Os dados serão coletados, tabulados em excel, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) versão 20, será o programa utilizado ou Stat4 ou Graphpad Prism para figuras, 10.3. Os dados serão testados quanto à normalidade pela calculadora Shapiro-Wilk, 10.3.1. Variáveis ​​normalmente distribuídas devem ser expressas como média + (S.E.M) e analisadas usando duas amostras independentes. O teste t de Student e ANOVA devem ser usados ​​para comparação de 2 ou mais grupos, se normalmente distribuídos, respectivamente.

10.3.2. Ajuste e normalização para fatores de confusão como idade e IMC, .. entre controle e pacientes, bem como análise de regressão múltipla ou ANCOVA para prever um fator de confusão, 10.3.3. Os dados a serem apresentados como mediana (intervalo), se não forem normalmente distribuídos, Mann-Whitney (U) ou Kruskal-Wallis (H) serão conduzidos para comparar entre dois ou mais grupos independentes, respectivamente, 10,4. Os valores de P foram bicaudais e considerados significativos se P <0,05,11.