"Keskiepigeneettisten välittäjien roolin tutkiminen rintasyöpäpotilailla"

Rintasyöpää pidetään yhtenä yleisimmistä naisten pahanlaatuisista kasvaimista maailmanlaajuisesti ja yhtenä yleisimmistä naisten kuolinsyistä maailmanlaajuisesti. Vaikka diagnoosi ja hoito ovat edistyneet huomattavasti, rintasyöpäpotilaiden ennuste on edelleen pettymys[1][2]. Rintasyöpä on erittäin heterogeeninen sairaus, joka luokitellaan neljään alatyyppiin tiettyjen hormonaalisten reseptorien ilmentymisen perusteella, kuten estrogeenireseptori ER, progesteronireseptori PR ja ihmisen epidermaalinen kasvutekijäreseptori HER2[2]. Seuraavat ovat neljä rintasyövän alatyyppiä: Luminaal A -kasvaimille on ominaista ER:n ja/tai PR:n esiintyminen ja HER2:n puuttuminen, Luminaal B -kasvaimet ovat korkeampia ja huonompi ennuste kuin Luminal A, ne ovat ER-positiivisia ja voivat olla PR-negatiivisia ja niillä on korkea Ki67-ekspressio (yli 20 %), HER2-positiivinen ryhmä muodostaa 10-15 % rintasyövistä ja sille on ominaista korkea HER2:n ilmentyminen ER:n ja PR:n puuttuessa ja kolminkertaisesti negatiivinen rintasyöpä, joista puuttuu kolmen edellisen reseptorin ilmentyminen [3][4].

Geeniekspression epigeneettinen säätely on geenin ilmentymisfunktion muutosta muuttamatta nukleotidisekvenssiä. Sekä syöpään liittyvien geenien aktivoituminen että inaktivoituminen voi tapahtua epigeneettisten mekanismien avulla. Tärkeimmät toimijat geenisäätelyn epigeneettisissä mekanismeissa ovat DNA:n metylaatio, histonien modifikaatio, kromatiinin remodelers ja ei-koodaava RNA:n ilmentyminen [5].

Histonimodifikaatiot ovat yksi tärkeimmistä kromatiinin rakenteen säätelijöistä, joka on erittäin tärkeä geenin ilmentymiselle, koska se määrittää DNA:n saatavuuden transkription säätelijöille, vaikuttaa geenien ilmentymiseen ja solun elintärkeisiin prosesseihin [6].

Histonimodifikaatiot voivat värvätä transkriptiotekijöitä, kromatiinin uudelleenmuodostajia ja kromatiinin rakenneproteiineja, joten ne edistävät aktiivisen tai repressiivisen kromatiinitilan muodostumista ja ylläpitämistä[6]. Tärkeimmät histonimodifikaatiot ovat: lysiinin asetylaatio, lysiinin ja arginiinin metylaatio, seriini/treoniini/tyrosiinifosforylaatio ja seriini/treoniini ubikvitylaatio [6]. Monet histonin modifikaatioentsyymit mutatoituvat usein erityyppisissä syöpätyypeissä esimerkiksi: EHMT2 (G9A) koodaa metyylitransferaasia, joka metyloi histoni H3:n lysiinitähteet, H3:n metylaatio lysiinissä 9 tällä proteiinilla johtaa uusien epigeneettisten säätelijöiden värväämiseen ja syöpäsolujen repressioon. transkriptio. Histonimetyylitransferaasi G9a on hyvin dokumentoitu sen vaikutuksesta neoplastiseen kasvuun[7]. Toinen esimerkki histonin modifikaatioentsyymeistä on KMT5B (SUV420H1) metyylitransferaasientsyymi, joka katalysoi H4k20me-merkin, repressiivisen merkin, kerrostumista ja jolla uskotaan olevan kasvainsuppressorin rooli monissa syöpätyypeissä[8].

Kromatiinin rakennetta voidaan säädellä myös kromatiinin uudelleenmuokkaajan komplekseilla, ne ovat neljä konservoitunutta ATP-riippuvaisten kromatiinin remodelers-perhettä nisäkkäissä (CHD), (ISWI), (INO80) ja (SWI/SNF), ja ne ovat mukana useimmissa olennaiset soluprosessit [9].

Kromatiinin modifiointikoneisto on erittäin epäsäännöllinen syövissä, mukaan lukien rintasyöpä, esimerkiksi: SWI/SNF-kompleksin alayksiköitä koodaavien geenien mutaatioita tai inaktivoitumista havaitaan noin 20 prosentissa syövistä[10].

Toinen tärkeä epigeneettinen mekanismi on ei-koodaavien RNA:iden vaikutus geeniekspressioon.

Ei-koodaavat RNA:t (ncRNA:t) ovat heterogeeninen ryhmä transkripteja, joita ei transloida proteiineihin. Ne ovat nousseet tärkeiksi useiden biologisten toimintojen säätelijöiksi, ja niiden säätelyhäiriöt ovat osallisena sairauksissa, mukaan lukien syöpä. Ne ovat saaneet valtavan kiinnostuksen tiedeyhteisön keskuudessa, koska niitä käytetään sairauden biomarkkereina. On olemassa monenlaisia ​​ncRNA:ita, mukaan lukien miRNA:t ja lncRNA:t[11].

MikroRNA:t (miRNA:t) ovat pieniä, erittäin konservoituneita ei-koodaavia RNA-molekyylejä (18-25) nukleotidia, jotka osallistuvat geeniekspression säätelyyn. Kertyvät tutkimukset ovat osoittaneet, että mikroRNA:t (miRNA:t) ovat uusia säätelyaineita, jotka toimivat kasvaimen suppressoreina tai onkogeeneinä kasvaimen etenemisessä[12]. On raportoitu, että eksosomaalisella miR-138-5p:llä on onkogeeninen toiminto rintasyöpäpotilailla estämällä KDM6B-proteiinia[13]. Peng Bian MD et al raportoivat, että miR-4306:n ilmentymisen ilmoitettiin vähentyneen rintasyöpäkudoksissa verrattuna viereisiin kudoksiin [14].

Pitkät ei-koodaavat RNA:t (lncRNA:t) ovat toisen tyyppisiä ei-koodaavia RNA:ita, jotka ovat pituudeltaan yli 200 nukleotidia ja joista useimpia ei muunneta proteiineihin[15]. Huolimatta siitä, että useimpia lncRNA:ita ei käännetä, ne ovat saaneet valtavan kiinnostuksen tutkimukseen, koska ne säätelevät muiden kohdegeenien geenien ilmentymistä[15]. LncRNA:t säätelevät geeniekspressiota epigeneettisellä, transkriptionaalisella, transkription jälkeisellä, translaation ja translaation jälkeisellä tasolla olemalla vuorovaikutuksessa mRNA:n, DNA:n, proteiinin ja miRNA:n kanssa[16]. Lisäksi niillä on ratkaiseva rooli biologisten prosessien ylläpitämisessä, kuten histonin modifikaatiossa, kromatiinin uudelleenmuodostuksessa, transkription häiriöissä, transkription aktivoinnissa, mRNA:n translaatiossa ja RNA:n prosessoinnissa[16]. Äskettäin todettiin, että lncRNA:t osallistuvat moniin syöpiin, kuten keuhkosyöpään, maksasyöpään, eturauhassyöpään, virtsarakkosyöpään ja rintasyöpään[2], joten niitä voidaan käyttää uutena biomarkkerina ja farmaseuttisena kohteena syövän hoidossa [17]. Esimerkiksi onkogeeninen lncRNA PVT1 edistää rintasyöpäsolujen lisääntymistä miR-181a-2-3p/ESR1-akselin kautta [18]. Tärkeää on, että lncRNA:illa voi olla ylikuulumista kromatiinia modifioivien ja uudelleenmuovattavien kompleksien kanssa monien normaaleiden solureittien sekä karsinogeenisten reittien tiukasti säätelemiseksi. Ne voivat säädellä kromatiinin modifiointikoneistoa joko suoralla vuorovaikutuksella tai epäsuorasti tiettyjen miRNA:iden sientämisen kautta. Esimerkki suorasta vuorovaikutuksesta syövässä: LncRNA UCA1 säätelee kromatiinin uudelleenmuodostumista sitoutumalla SMARCA4:ään heikentääkseen sen sitoutumista alueelleen p21-promoottorissa, mikä johtaa virtsarakon syövän proliferaatioon[19]. Esimerkki epäsuorasta vuorovaikutuksesta syövässä: LncRNA-MIAT edistää kilpirauhassyövän etenemistä ja toimii seRNA:na EZH2:n kohdentamiseksi miR-150-5p:n avulla[20].

LncRNA:t voidaan havaita plasmasta/seerumista, joten ne toimivat ei-invasiivisina biomarkkereina [21].

LncRNA UPK1A-AS1 on äskettäin tunnistettu syövän biomarkkeri. On raportoitu, että sillä on onkogeeninen rooli haimasyövässä, koska se antaa platinaresistenssin kaksoisnauhakatkon korjaamisen kautta[22]. Lisäksi todettiin, että UPK1A-AS1 edisti HCC:n lisääntymistä olemalla vuorovaikutuksessa EZH2:n kanssa[23]. Huolimatta siitä tosiasiasta, että lncRNA UPK1A-AS1:n raportoitiin olevan onkogeeninen HCC:ssä, haimasyövässä ja keuhkosyöpäsolulinjoissa, sillä uskottiin olevan tuumorisuppressori rooli ruokatorven levyepiteelisyöpäsolusyövässä sienimäisen miR-1248:n kautta[24][24][ 25].

LncRNA UNC5B-AS1 on tunnistettu onkogeeniksi kilpirauhassyövässä, eturauhassyövässä ja HCC:ssä [26] [27]. Todettiin myös, että sillä on onkogeeninen rooli munasarjasyövässä säätelemällä histonimuutoksia[28].

LncRNA:iden UPK1A-AS1 ja UNC5B-AS1 roolia rintasyöpäpotilaiden patogeneesissä ei kuitenkaan ole vielä paljastettu.

1.2. Ongelman määritelmä. Egyptissä rintasyöpä on naisten yleisin pahanlaatuinen syöpä, ja useimmat tapaukset diagnosoidaan myöhäisessä vaiheessa huonolla ennusteella[29]. Vuonna 2050 ennustetaan tapahtuvan noin 46 000 tapausta. Vaikka ilmaantuvuus Egyptissä on alhaisempi kuin maailmanlaajuiset luvut., kuolleisuus on paljon korkeampi verrattuna kehittyneisiin maihin noin kaksinkertaiseksi (41% vs 23%) [30]. Joten uusien merkkiaineiden tarjoaminen rintasyövän diagnoosiin ja/tai ennusteeseen sekä niiden molekyylimekanismien ymmärtäminen karsinogeneesin kanssa on edelleen haaste rintasyövän hoidossa.

1.3. Hypoteesi. Ongelmana on tarjota uusia markkereita, joita ei ole aiemmin tutkittu rintasyöpäpotilailla auttamaan tämän aggressiivisen taudin diagnosoinnissa ja ennustamisessa. Tämän mukaisesti tässä tutkimuksessa tutkimme pitkien ei-koodaavien RNA:iden UPK1A-AS1 ja/tai UNC5B-AS1 roolia mahdollisina diagnostisina ja/tai prognostisina markkereina rintasyövässä. Lisäksi tutkitaan mahdollista ylikuulumista ja korrelaatiota näiden pitkien ei-koodaavien RNA:iden ja kromatiinimodifikaatioentsyymien ja/tai uudelleenmuotoilukompleksien, kuten KMT5B ja G9A, välillä tiettyjen kohdemiRNA:iden, kuten mir-138-5p ja mir-4306, välillä. 2. AIEEMMAT TUTKIMUKSET 2.1. Zhang et ai. raportoi, että: UPK1A-AS1 edistää HCC:n kehitystä kiihdyttämällä solusyklin etenemistä vuorovaikutuksen EZH2:n kanssa ja miR-138-5p:n leviämisen kautta [23].

2.2. Wang et ai. raportoi, että: UNC5B-AS1 edisti munasarjasyövän etenemistä säätelemällä NDRG2:n H3K27me:tä EZH2:n kautta[28].

2.3. Hauang et ai. raportoi, että: UNC5B-AS1 edistää hepatosellulaaristen karsinoomasolujen proliferaatiota, migraatiota ja EMT:tä säätelemällä miR-4306/KDM2A-akselia [26].

3. TYÖN TAVOITE Ehdokkaidemme lncRNA:iden UPK1A-AS1 ja/tai UNC5B-AS1 ilmentymistasojen arvioiminen ja korreloiminen eri kliinisten parametrien kanssa rintasyöpäpotilailla sekä niiden mahdollisen ylikuulumisen valottaminen kromatiinia modifioivien ja/tai uudelleenmuovattavien proteiinien kanssa. KMT5B:nä ja G9A:na rintasyöpäpotilailla käyttämällä tiettyjä kohdemiRNA:ita, kuten mir-138-5p ja mir-4306.

4. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET 4.1. Mittaa lncRNA UPK1A-AS1 ja/tai UNC5B-AS1 ja niiden kohdemiRNA:iden geeniekspressio rintasyöpäpotilaiden seeruminäytteistä (nestebiopsia) ja/tai kudosnäytteistä käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiotekniikkaa (qRT-PCR).

4.2. Mittaa seerumin ja/tai kudoksen kohdeproteiinien taso ELISA:lla. 4.3. Vertaa näitä ncRNA:iden ilmentymistasoja klassisiin proteiinikasvainmarkkereihin, 4.4. Korreloi nämä ncRNA:t ja kohdeproteiinitason akseli rintasyövän kliinispatologisiin ominaisuuksiin, kuten kasvaimen vaiheeseen ja asteeseen, kasvaimen etenemiseen (TNM) ja muihin klassisiin klinopatologisiin prognostisiin biomarkkereihin, kuten karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA), syöpäantigeeni 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 (HER2/neu), proliferaatiomarkkeri Ki-67 tai PCNA ja täydellinen verenkuva (CBC), BMI, BP, veren glukoositaso ja insuliini.

5. TUTKIMUKSEN TULOKSET 5.1. Ensisijainen. Selvitä rintasyöpäpotilaiden nestebiopsiasta ja/tai kudosnäytteistä saatujen lncRNA-ehdokkaidemme rooli ja niiden alavirran kohteet.

5.2. Julkaisu(t)/Näkyvyystulos. Arvosteluartikkeli + yksi kansainvälinen Scopus Q1 -julkaisu, joka käsittelee löydettyjä tuloksia + esittelee löydöksiä kansainvälisessä korkean maineen konferenssissa.

6. TUTKIMUKSEN MERKITYS 6.1. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimustyö, jossa mitataan UPK1A-AS1:n ja/tai UNC5B-AS1:n ilmentymistasoa rintasyövän kliinisissä näytteissä.

6.2. Nämä tiedot voivat tarjota lupaavan lähestymistavan uusien merkkiaineiden käyttöönotossa, jotka auttavat rintasyövän diagnosoinnissa ja ennusteessa ja tarjoavat mahdollisia kohteita geeniterapialle.

7. TUTKIMUSMENETELMÄT 7.1. Bioinformatiikka-analyysi 7.1.1. Tutkimme ehdokkaiden lncRNA:iden ilmentymistä rintasyöpänäytteissä geeniekspression profiloinnin interaktiivisesta analyysistä (GEPIA) perustuen The Cancer Genome Atlas -tietoihin (TCGA).

7.1.2. KohdemiRNA:iden tutkiminen bioinformatiikan työkaluilla ja/tai kokeellisilla tutkimuksilla käyttämällä online-ohjelmistoa miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Valittujen miRNA-kohdegeenien tutkiminen miRNA-verkkotyökalujen avulla: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase tai ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ ja kohdeskannaus: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Reittianalyysi tai geeniontologia kohdegeenien luetteloa varten enrichr-tietokannan kautta, kohdegeenien luettelo analysoitiin niiden suhteen suhteen kromatiinia modifioiviin ja/tai uudelleenmuovaaviin proteiineihin.

8. EETTINEN LAUSUNTO 8.1.1. Tämä tutkimus suoritetaan Helsingin julistuksen asettamien ohjeiden mukaisesti viitaten Maailman lääketieteellisen liiton (WMA) alun perin vuonna 1964 julkaistuihin ihmisiin kohdistuvan lääketieteellisen tutkimuksen eettisiin ohjeisiin, joita tarkistettiin vuonna 2013 ja lokakuussa 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Näytteet kerätään, kun osallistuja on ilmoittanut asiasta ja allekirjoittanut tietoisen suostumuksen.

8.1.2. Eettinen hyväksyntä ja suostumus osallistumiseen. Tämän tutkimuksen hyväksyi ensimmäisenä Ain Shams -yliopiston farmasian tiedekunnan Research Ethical Committee (REC). 9. OTEKOKO JA TUTKIMUKSEN VOIMA 9.1. Arvioitu otoskoko laskettiin G power* -otoskoon online-laskimella http://www.gpower.hhu.de/en.html, käyttämällä seuraavia syöttötietoja: α-virhetodennäköisyys on (0,05), tutkimuksen teho (0,8). Perustuu aikaisempiin tutkimuksiin, jotka ovat suorittaneet Bian et al, 2021; Huang et al, 2021; Tan et ai, 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25], joka osoitti kohtalaista tai suurta vaikutuskokoa, kohtalainen vaikutuskoko (0,5) valittiin otoskoon laskemiseen.

Otoskoko on yhteensä 102 tapausta, jotka jaetaan kahteen ryhmään joko suhteessa 50:50 tai suhteella 60:40.

9.2. Opintojen suunnittelu. Tapauskontrolloitu, retrospektiivinen, yksikeskustutkimus. 9.3. Tutkimuksen osallistujat. Sarja egyptiläisiä naispuolisia rintasyöpäpotilaita rekrytoidaan Ain Shams -yliopiston Kairon, Egyptin kliinisen onkologian osaston rintasyöpäyksiköstä.

ryhmä 1; pahanlaatuiset ei-metastaattiset rintasyöpäpotilaat; vasta diagnosoidut rintasyöpäpotilaat.

ryhmä 2; kontrolliryhmä; terveitä vapaaehtoisia. 9.3.1 Kliinis-patologinen Kriteerit. Kliiniset tiedot, jotka on saatu lääketieteellisistä tiedoista ja alkuperäisistä patologiaraporteista. Nämä tiedot kootaan yksityiskohtaiseen Excel-tiedostoon.

Seuraavat kliiniset tiedot tallennetaan ja arvioidaan liitteenä olevan Excel-tiedoston mukaisesti.

• Kaikista rintasyöpään osallistuneista kirjataan koko sukuhistoria.
• Yksilöllinen syöpähistoria ja kasvaimen kliininen arviointi tehty käyttämällä American Joint Committee on Cancer (AJCC) -luokitusta (TNM).
• Histologisessa arvioinnissa käytetään Bloom-Richardsonin asteikkoa.
• Rintasyöpäpotilaiden ominaisuudet painoindeksin (BMI), CBC:n, menopausaalisen tilan, rintasyövän histopatologisten tyyppien suhteen; invasiivinen ductal carcinoma (IDC) ja invasiivinen lobulaarinen karsinooma (ILC). Rintasyövän molekyyliluokitukset luminaalinen A, B, kolminkertaisesti negatiivinen rintasyöpä.
• Kasvainkoko sekä kliinis-patologiset biomarkkerit CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 tai PCNA (jos sellaisia ​​on) kerätään potilastiedostoista lisäkorrelaatioita ja tilastollista analyysiä varten.

9.3.2. Sisällyttämiskriteerit; Egyptiläiset 18-vuotiaat ja sitä vanhemmat rintasyöpäpotilaat, joilla on äskettäin diagnosoitu rintasyöpä.

9.3.3 poissulkemiskriteerit; verisairaudet, muut syövät kuin rintasyöpä, maksakirroosi ja kohdun ja virtsarakon sairaudet tai rintasyöpäpotilaat, joilla on merkkejä etäpesäkkeistä.

9.4 Verinäytteenotto: 6 ml perifeeristä verta kerätään polymeerigeelivacutainers -säiliöihin, joissa on hyytymisaktivaattori (Greiner Bio-One GmbH, Australia), jätetään 15 minuutiksi. huoneenlämmössä hyytymään, minkä jälkeen 10 min. sentrifugoidaan 10 000 g 4 °C:ssa, saadut seerumit jaetaan 5 puhtaaseen Eppendorf-putkeen ja säilytetään -80 °C:ssa biokemialliseen arviointiin asti Ain-Shamsin yliopiston farmasian tiedekunnan biokemian laitoksella.

9.4.1 Varastoituja seerumeita käytetään ELISA-tekniikalla kohdeproteiinitasojen mittaamiseen käyttäen kaupallisesti saatavia ELISA-pakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti.

9.4.2. Genominen RNA uutetaan; ncRNA:iden uuttaminen seeruminäytteistä ja puhdistuksen arviointi. ncRNA:iden ilmentymistason kvantifiointi käyttäen qRT-PCR:ää vaiheella yksi plus. Jatkamme kokonais-RNA:n uuttamista seeruminäytteestä käyttämällä miRNeasy Mini Kitiä. c-DNA-synteesi tehdään myöhemmin käyttämällä VERSO c-DNA -synteesisarjaa (Thermo Scientific, USA).

Seuraavaksi teemme kvantitatiivisia reaaliaikaisia ​​PCR-analyysejä (qRT-PCR) käyttämällä sybr green PCR master mixiä (Thermo Scientific, USA) ja spesifisiä kohde-ncRNA:ille suunniteltuja alukkeita sekä taloudenpidon referenssigeeniä.

10. TILASTOANALYYSI 10.1. Tiedot kerätään, excel-taulukoita, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) versio 20, on käytetty ohjelma tai Stat4 tai Graphpad Prism hahmoille, 10.3. Data testataan normaaliuden suhteen Shapiro-Wilk-laskimella, 10.3.1. Normaalijakautuneet muuttujat on ilmaistava keskiarvo+(S.E.M) ja analysoitava käyttämällä kahta otosta. Riippumattomien opiskelijoiden t-testiä ja ANOVAa on käytettävä kahden tai useamman ryhmän vertailuun, jos ne jakautuvat normaalisti.

10.3.2. Säätö ja normalisointi sekatekijöiden, kuten iän ja BMI:n, .. kontrollin ja potilaiden välillä sekä moninkertainen regressioanalyysi tai ANCOVA sekatekijän ennustamiseksi, 10.3.3. Mediaanina (alue) esitettävät tiedot, jos ne eivät jakaannu normaalisti, Mann-Whitney (U) tai Kruskal-Wallis (H) suoritetaan vertaamaan mitä tahansa kahden tai useamman riippumattoman ryhmän välillä, vastaavasti. 10.4. P-arvot olivat kaksisuuntaisia ​​ja katsottiin merkitseviksi, jos P <0,05,11.