NPM1変異低リスク急性骨髄性白血病における間葉系幹細胞：腫瘍微小環境とその転帰への影響に関する研究

背景 急性骨髄性白血病（AML）は、骨髄系前駆細胞のクローン性増殖と分化停止を特徴とする不均一な血液悪性腫瘍です。

AMLの病因に関する現在の知見は不完全ではあるものの、患者を異なる予後グループに層別化し、個別化治療戦略の出現につながっています。

欧州白血病ネットワーク（ELN）は、遺伝子変異と染色体異常に基づき、新規AMLを良好、中間、不良リスク群に層別化します。 特に、良好リスクプロファイルの患者は、コア結合因子再構成（CBF）の存在、核タンパク質1（NPM1）変異とfms関連受容体チロシンキナーゼ3（FLT3）野生型を伴う正常核型、NPM1変異と低アレル比のFLT3-内部タンデム重複、またはCCAAT/エンハンサー結合タンパク質α（CEBPα）の二アレル変異のいずれかによって特徴づけられます。

良好リスクプロファイルにもかかわらず、従来の化学療法後の長期経過観察中の患者では、NPM1変異AMLで最大50%、CBF AMLで40%、CEBPα二アレル変異AMLで44%の再発率が報告されています。 これらのデータは、良好リスクAMLにおいて病因および耐性メカニズムに関するさらなる知見を得るための調査の必要性を強調しており、それにより患者層別化の改善が期待されます。 さらに、これらの知見は新規治療標的の発見につながる可能性があります。

NPM1はAMLで最も頻繁な変異であり、新規細胞遺伝学的正常AMLの約50-60%を占めます。 マウスおよびin vivo研究では、NPM1変異が白血病発生と骨髄増殖を促進するが、白血病を誘発するには不十分であることが示されています。 造血幹細胞（HSCs）の既存変異は、白血病発生に協力する可能性のあるメカニズムかもしれません。 これらの変異は主に造血幹細胞または前駆細胞のエピジェネティック修飾因子に関与し、明らかな血液疾患のない個体におけるそれらのクローン性増殖をもたらします。 この状態は、クローン性造血と呼ばれ、白血病発生を駆動できる変異の出現を促進する可能性のある前白血病状態を表します。 実際、NPM1変異は、シグナル伝達経路、DNAメチル化、RNAスプライシング、コヘシン複合体、遺伝子転写、および腫瘍抑制に関与する遺伝子の共起変異と頻繁にクラスターを形成します。

一部の共起変異が疾患予後に悪影響を与えることを示した研究は少ないものの、その実際の影響については依然として議論があります。 したがって、変異状況だけではこの低リスク白血病群の一部の患者の臨床経過を完全に説明することはできず、他の要因がこのAMLサブグループの不均一性に役割を果たしている可能性があります。 最近、疾患難治性と再発に関与する白血病性造血ニッチに関する知見を得るために大きな努力が払われています。

造血幹細胞は、骨髄微小環境との相互作用を通じて、特定の骨髄ニッチにおいてその増殖、分化、および自己再生プロセスを調節します。 微小環境には、主に間葉系幹細胞（MSCs）から構成されるが、骨芽細胞、内皮細胞、マクロファージも含まれる細胞区画があります。 特に、MSCサブグループはHSCs活性の調節において異なる役割を持ちます。

白血病幹細胞は、自己再生能力と幹細胞特性を持つ白血病細胞の小さなサブグループです。 定義上、これらの細胞はレシピエント宿主に移植された場合、白血病を再開始することができます。

骨髄微小環境は、白血病幹細胞（LSCs）とも相互作用し、その増殖、接着特性、静止状態、およびクローン性増殖を変化させます。

同時に、研究はLSCsがMSCsを再プログラミングし、栄養サポート、酸化ストレスからの保護、および毒性化学療法剤からの保存を受け、「白血病ニッチ」の形成を促進することを示しています。 一方、骨髄MSCsはLSCsと直接的または間接的に相互作用し、LSCsの増殖、接着特性、静止状態、およびクローン性増殖を変化させます。 その結果、MSCsはLSC維持に寄与します。 MSCリモデリングは、臨床的異質性を説明する可能性のある白血病発生自己再生戦略であり、したがって潜在的な予後因子となる可能性があります。

いくつかの研究は、AML患者における骨髄MSCsレベルでの機能的変化の存在、例えば増殖の減少、アポトーシス率の増加、および炎症前状態を明らかにしています。

骨髄微小環境はAMLにおける化学療法耐性の促進に重要な役割を果たしているように見えますが、これらの変化または他の変化が白血病病因に関連しているかどうかは依然として不明です。

AML患者はMSCs特性が変化しています；特に、健康なドナー（HD）と比較して、CD146+/nestin+と定義される原始的なMSCsの量が減少しています。 Nestin+骨髄MSCsは、酸化的リン酸化を刺激し、それによりエネルギー生産を増加させることにより、白血病細胞の生存と化学療法耐性を増強します。 このサブ集団は疾患経過に関連しているようです：再発した患者は、寛解中の被験者と比較してCD146+/nestin+ MSCsの割合が増加しています。

さらに、修正されたMSCsはHSCおよびLSCと異なって相互作用し、それぞれ正常造血を選択的に抑制し、白血病発生と化学療法耐性を促進します。 白血病細胞の間質媒介保護のメカニズムは複雑であり、LSCs増殖を促進するサイトカイン、ケモカイン、可溶性因子、および微小小胞（MVs）のネットワークを含みます。 作用メカニズムの一つとして、骨髄間質細胞とLSCsの間の相互作用が、MSCsによるCXCL12の放出とLSCs表面のCXCR4受容体への結合を通じて行われることが考えられます。 より詳細には、白血病細胞は、通常は正常HSCに制限されている保護的な骨髄ニッチへのホーミングのためにCXCL12/CXCR4軸を利用します。 その結果、LSCsはその生存を促進し、化学療法から保護する環境に留まります。 この理由から、CXCL12/CXCR4軸は再発を防止するための将来の治療の標的となる可能性があります。

私たちの知る限り、NPM1変異AMLにおける骨髄微小環境の特性評価に関するデータはありません。 骨髄微小環境の最も代表的な構成要素としてのMSCsの特性評価は、これらの患者で観察される高い再発率を説明する可能性のある特定の細胞メカニズムの同定に有用である可能性があります。

研究目的

一般目的：

AML NPM1mut患者の骨髄MSCsを特徴づけ、患者の臨床転帰の新規指標として可能性を探る。

詳細には、AML-MSCsの表現型、遺伝子プロファイル、および機能を研究し、骨髄微小環境レベルでのAML NPM1mutにおける治療抵抗性と再発発生を促進するメカニズムを理解するために、その傍分泌活性を評価します。 MSCsの傍分泌活性は、枯渇後にMSCsによって放出される微小小胞の研究および特性評価を通じて評価されます。

一次目的：

本研究の一次目的は、診断時のCD146+ MSCs割合の検出です。このサブ集団はLSCニッチ形成と化学療法耐性に関与しているようです。 再発患者の骨髄は、臨床的寛解中の患者と比較してこのMSCサブ集団の割合が高いことが報告されています。 目的は、AML NPM1mut患者において、HD-MSCsおよびDC-MSCs（疾患対照MSCs：NPM1野生型AML患者）と比較して、診断時のCD146+ MSC割合に統計的に有意な差があることを実証することです。

共同一次目的：

全人口（AML NPM1mutおよびAML-NPM1wt）における再発患者と再発しない患者の間での、診断時および異なる時点（診断、導入後、治療終了、経過観察、移植前、再発）でのCD146+細胞割合の比較

二次目的：

1. 各事前定義時点でのAML NPM1mutおよびAML NPM1wt患者におけるMSCs CD146+サブ集団の比較。

2. AML NPM1mut患者とAML NPM1wt患者におけるAML-MSCsの特性評価。 MSCsの定義に関する国際ガイドライン（Dominici et al., 2006）に従い、形態、プラスチックへの接着能力、クローン形成効率、増殖能力、および老化への移行が評価されます。 表面マーカーCD105、CD73、およびCD90の発現、およびCD45、CD34、CD14、CD19、およびHLA-DRの欠如は、モノクローナル抗体による標識および多変量フローサイトメトリー（MFC）（FacsCanto II、Becton Dickinson）による評価を通じて評価されます。 CD146およびnestin発現は、特定の時点で得られたサンプルで評価されます。 AML-MSCsの脂肪細胞および骨細胞への分化能力は、適切な分化因子による「in vitro」刺激後に決定されます。

3. AML NPM1mut患者とAML NPM1wt患者からのMSCsの機能的特性評価。 MSCsの機能的特性は、自己環境（患者の末梢血単核細胞（PBMCs）/患者のMSCs）および同種環境（健康ドナーのPBMCs/患者のMSCs）におけるAML-MSCsの共培養の開発を通じて評価されます。 次に、免疫調節潜在能、T、B、およびNKサブ集団を生成する能力、およびCXCR4/CXCL12軸の調節が評価されます。 さらに、培養上清中の炎症促進性および調節性サイトカインが定量化されます。
4. AML NPM1mut患者とAML-NPM1wt患者におけるMSCsのゲノム特性評価 骨髄性腫瘍で再発変異する遺伝子パネルを用いた次世代シーケンシング（NGS）により、同じ患者の白血病芽球から抽出したDNAと共に分析されます。

三次探索目的

• 将来のin vitro研究のための共培養に向けたCD146+/nestin+ MSCsサブ集団のソーティング
• 枯渇後にAML-MSCsによって放出されるMVsの単離および特性評価。
• その傍分泌活性を評価するために、MVsを伴うHDからのPBMCs培養の開発。

研究デザイン これはパイロット単施設前向き観察的、縦断的、in vitro研究です

被験者および包含基準 フォンダツィオーネIRCCSポリクリニコ・サン・マッテオ・ディ・パヴィアの臨床血液学で診断された新規発症急性骨髄性白血病の成人患者。

対照は、小児血液腫瘍学により、インフォームドコンセントに署名した後、骨髄移植のための造血幹細胞の健康ドナーです。

サンプル収集 選択された時点（診断、導入終了、地固め終了、経過観察、造血幹細胞移植（HSCT）前、再発）での骨髄MSCsの増殖および分析。

同じ時点で、末梢血サンプルが収集されます。 各計画時点は、通常の臨床実践における骨髄穿刺および血液採取を表します。

方法

一次および共同一次目的：

フォンダツィオーネIRCCSポリクリニコ・サン・マッテオ・ディ・パヴィアで診断された新規発症急性骨髄性白血病の60人の患者が3年間に登録されます；

一次および共同一次目的：

標準手順として、登録患者の骨髄穿刺は、診断、導入終了、地固め終了、経過観察、HSCT前後、再発時に収集されます。

MSCsは、AML NPM1mutおよびAML-NPM1wt被験者の骨髄から単離され、その後、老化まで5%溶解DMEM+培養培地で「in vitro」培養されます。

表面マーカーCD146およびnestinの発現は、細胞質内標識およびその後のMFC FacsCanto II（BD）による分析を通じて評価されます。 疾患発症時のAML NPM1mut患者におけるCD146+/nestin+ MSCs割合と、HDおよび疾患対照の割合が比較されます。

二次目的：

患者の骨髄MSCsの特性評価は、クローン形成効率（コロニー形成単位、CFU-f）を評価することにより行われます。 同時に、増殖能力は累積人口倍加（cPD）の観点から評価されます。 AML-MSCsの老化は、回収された細胞数が培養された細胞数以下である時点と定義されます。 老化細胞は、β-ガラクトシダーゼを使用して検出されます。

AML-MSCsの脂肪細胞および骨細胞への分化能力は、in vitroで特定の因子の添加によって駆動されます：アリザリンレッド染色は脂質滴を特異的に染色し、一方アルカリホスファターゼ染色は骨細胞に典型的なカルシウム沈着の存在を強調します。

同じ時点で、末梢血サンプルが収集され、臨床活動中に行われる標準的な診断分析の残りとなります。 サンプルからPBMCsが抽出され、その後の免疫調節実験に使用されます。

AML-MSCsの機能的特性は、PBMCsとの共培養後に評価されます。 3日間のインキュベーション後、MSCsのPBMCs増殖調節能力は、トリチウム標識チミジンの取り込みを通じて分析されます。 結果は、HD-MSCおよび疾患対照から得られた結果と比較されます。

同じ培養中で10日間のインキュベーション後、AML-MSCsのリンパ球サブ集団（TおよびBリンパ球およびNK細胞）の割合をMFCを通じて調節する能力が、細胞質内Foxp3の測定によるT調節細胞の割合、および患者リンパ球表面のCXCR4発現と共に評価されます。 培養上清は保存され、ELISAによるCXCL12、IL-6、IFN-γ、IL-10、PGE-2の定量に使用されます。

AML NPM1mutおよびAML NPM1wt被験者からのMSCsから抽出されたDNAは、同じ患者の白血病芽球から抽出されたDNAと共に、Illumina MiSeqによってシーケンスされた54遺伝子のカスタムTruSight骨髄性シーケンシングパネルを通じて分析されます。

三次探索目的 CD146+/nestin+ MSCs割合が適切であれば、このサブ集団がソートされ、上記の分析がそれに対して行われます。

MVsは超遠心分離を通じて単離され、定量化されます（NanoSight）。 MVs表面マーカーの発現は、MACSPlex Exosomes Kit（Miltenyi）およびMacsQuant Flow Cytometer（Miltenyi）を通じて評価されます。

MVsのタンパク質含有量は、HPLCおよび質量分析を通じて評価されます。

MVs存在下での共培養実験が開発されます。

データ収集 データは電子データベースに記録されます。 患者はそのプライバシーを保証する識別コードを受け取ります。 主任研究者は、患者の識別データと対応するコードを含むリストを別途保持します。

サンプルサイズ計算 90人の被験者が登録されます（60人の患者：30人AML NPM1mut、30人AML NPM1wt、および30人HD-MSCs）。 このサンプルサイズにより、一元配置分散分析後の2x2事後比較（両側タイプI誤差α=0.017）で、平均間の差が共通標準偏差の85%である場合、nestin+/CD146+ MSCsレベルにおいて有意差を検出することが可能です。 80%の検出力が考慮されています。

統計分析 質的変数は、各カテゴリの絶対的および相対的頻度として記述されます。 量的変数は、平均±標準偏差、または中央値と四分位範囲によって要約されます。 必要に応じて、データの対数変換が採用されます。

統計分析はStata 17（StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.）を使用して行われます。

主要エンドポイントの統計分析 ベースライン時のNestin+/CD146+ MSCsレベルは、一元配置分散分析によって3群間で比較され、その後Bonferroniの2x2事後比較が行われます。

共同主要エンドポイントの統計分析 異なる時点でのnestin+/CD146+ MSCsレベルと再発との関連は、縦断的および生存データの結合モデルによって評価されます。

二次エンドポイントの統計分析

1. NPM1変異状態に従った比較は、多レベル混合（患者をランダム効果として扱う）線形またはロジスティックモデルを適合させることによって行われます。
2. MSCsと白血病細胞の間の相互作用は、多レベル混合（患者をランダム効果として扱う）線形またはロジスティックモデルを適合させることによって分析されます。
3. AML NPM1mut患者とAML-NPM1wt患者を比較するために、Fisherの正確検定が行われます。

三次探索エンドポイントの統計分析 三次探索エンドポイントについては、記述統計が使用されます。

インフォームドコンセント 各患者は研究情報資料を受け取り、署名済みインフォームドコンセントフォームが取得されます。

情報リーフレットおよびインフォームドコンセントは、患者が追加の採血および骨髄穿刺を受けないことを明確にします。