Komórki mezenchymalne w niskiego ryzyka ostrej białaczce szpikowej z mutacją NPM1: badanie mikrośrodowiska guza i jego wkładu w wynik leczenia

Tło Ostra białaczka szpikowa (AML) jest heterogennym nowotworem hematologicznym charakteryzującym się klonalną ekspansją i zahamowaniem różnicowania komórek progenitorowych szpiku kostnego.

Chociaż niekompletna, obecna wiedza na temat patogenezy AML pozwoliła na stratyfikację pacjentów na różne grupy prognostyczne i doprowadziła do pojawienia się spersonalizowanych strategii leczenia.

Europejska Sieć Białaczkowa (ELN) klasyfikuje de novo AML na grupy o korzystnym, pośrednim i niekorzystnym ryzyku według mutacji genetycznych i nieprawidłowości chromosomalnych. W szczególności pacjenci z profilem korzystnego ryzyka charakteryzują się obecnością rearanżacji czynnika wiążącego rdzeń (CBF), prawidłowym kariotypem z mutacjami nukleofosminy 1 (NPM1) i dzikim typem receptora kinazy tyrozynowej fms 3 (FLT3), mutacjami NPM1 i wewnętrzną duplikacją tandemową FLT3 z niskim stosunkiem allelicznym lub biallelicznymi mutacjami w białku wiążącym CCAAT/wzmacniaczu α (CEBPα).

Pomimo korzystnego profilu ryzyka, pacjenci w długoterminowej obserwacji po konwencjonalnej chemioterapii mają wskaźniki nawrotów sięgające do 50% w AML z mutacją NPM1, 40% w AML CBF i 44% w AML z bialleliczną mutacją CEBPα. Dane te podkreślają potrzebę dalszych badań wśród AML o korzystnym ryzyku, aby zdobyć więcej wiedzy na temat mechanizmów patogenetycznych i oporności, poprawiając tym samym stratyfikację pacjentów. Ponadto, te spostrzeżenia mogą prowadzić do odkrycia nowych celów terapeutycznych.

NPM1 jest najczęstszą mutacją w AML, stanowiąc około 50-60% de novo cytogenetycznie prawidłowej AML. Badania na myszach i in vivo wykazały, że mutacja NPM1 promuje leukemogenezę i mieloproliferację, ale nie jest wystarczająca do wywołania białaczki. Wcześniej istniejące mutacje komórek macierzystych hematopoezy (HSC) mogą być możliwym mechanizmem współdziałającym w leukemogenezie. Mutacje te dotyczą głównie modyfikatorów epigenetycznych w komórkach macierzystych lub progenitorowych hematopoezy, powodując ich klonalną ekspansję u osób bez jawnej choroby hematologicznej. Ten stan, nazywany klonalną hematopoezą, reprezentuje stan przedbiałaczkowy, który może promować pojawienie się mutacji zdolnych do napędzania leukemogenezy. Rzeczywiście, mutacje NPM1 często występują razem z współwystępującymi mutacjami obejmującymi geny szlaków sygnałowych, metylacji DNA, splicingu RNA, kompleksu kohezyny, transkrypcji genów i supresji nowotworów.

Chociaż kilka badań wykazało, że niektóre współwystępujące mutacje negatywnie wpływają na rokowanie choroby, kontrowersje pozostają co do ich rzeczywistego wpływu. Dlatego sam krajobraz mutacyjny nie może w pełni wyjaśnić przebiegu klinicznego niektórych pacjentów w tej grupie białaczek niskiego ryzyka; inne czynniki mogą odgrywać rolę w heterogeniczności tej podgrupy AML. Ostatnio podjęto duże wysiłki, aby uzyskać wgląd w niszę hematopoetyczną białaczki, która jest zaangażowana w oporność na chorobę i nawroty.

Komórki macierzyste hematopoezy regulują swoje procesy proliferacji, różnicowania i samoodnawiania w specyficznej niszy szpiku kostnego, poprzez interakcję ze mikrośrodowiskiem szpiku kostnego. Mikrośrodowisko ma kompartment komórkowy, który składa się głównie z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), ale także osteoblastów, komórek śródbłonka, makrofagów. W szczególności podgrupy MSC mają różne role w regulacji aktywności HSC.

Komórki macierzyste białaczki są małą podgrupą komórek białaczkowych zdolnych do samoodnawiania i posiadających właściwości macierzystości. Z definicji, te komórki mogą ponownie zainicjować białaczkę, jeśli zostaną wszczepione do organizmu biorcy.

Mikrośrodowisko szpiku kostnego oddziałuje również z komórkami macierzystymi białaczki (LSC), zmieniając ich proliferację, właściwości adhezji, spoczynkowość i ekspansję klonalną.

Jednocześnie badania wykazały, że LSC mogą przeprogramowywać MSC i otrzymywać wsparcie troficzne, ochronę przed stresem oksydacyjnym i zachowanie przed toksycznymi środkami chemioterapeutycznymi, promując tworzenie "niszy białaczkowej". Z drugiej strony, MSC szpiku kostnego oddziałują z LSC, bezpośrednio lub pośrednio, i zmieniają proliferację LSC, właściwości adhezji, spoczynkowość i ekspansję klonalną. W rezultacie MSC przyczyniają się do utrzymania LSC. Przebudowa MSC jest strategią samoodnawiania leukemogenezy, która mogłaby wyjaśnić heterogeniczność kliniczną i tym samym mogłaby być potencjalnym czynnikiem prognostycznym.

Kilka badań ujawniło obecność funkcjonalnych zaburzeń na poziomie MSC szpiku kostnego u pacjentów z AML, takich jak zmniejszona proliferacja, zwiększony wskaźnik apoptozy i stan prozapalny.

Chociaż mikrośrodowisko szpiku kostnego wydaje się odgrywać kluczową rolę w promowaniu chemiooporności w AML, czy te zaburzenia lub inne są związane z patogenezą białaczki, nadal pozostaje niejasne.

Pacjenci z AML mają zmienione charakterystyki MSC; w szczególności występuje zmniejszona ilość prymitywnych MSC, zdefiniowanych jako CD146+/nestyna+, w porównaniu ze zdrowymi dawcami (HD). Nestyna+ MSC szpiku kostnego zwiększają przeżywalność komórek białaczkowych i chemiooporność poprzez stymulację fosforylacji oksydacyjnej, a tym samym zwiększając produkcję energii. Ta subpopulacja wydaje się być związana z przebiegiem choroby: pacjenci, którzy doświadczają nawrotu, mają zwiększony procent MSC CD146+/nestyna+ w porównaniu z osobami w remisji.

Ponadto, zmodyfikowane MSC oddziałują inaczej z HSC i LSC, selektywnie hamując normalną hematopoezę i promując odpowiednio leukemogenezę i chemiooporność. Mechanizm ochrony komórek białaczkowych przez stromę jest złożony i obejmuje sieć cytokin, chemokin, rozpuszczalnych czynników i mikropęcherzyków (MV), które promują proliferację LSC. Prawdopodobnym mechanizmem działania jest interakcja między komórkami stromalnymi szpiku kostnego a LSC poprzez uwalnianie CXCL12 przez MSC i jego wiązanie do receptora CXCR4 na powierzchni LSC. Bardziej szczegółowo, komórki białaczkowe wykorzystują oś CXCL12/CXCR4 do homingu w ochronnej niszy szpiku kostnego, która jest zwykle ograniczona do normalnych HSC. W rezultacie LSC przebywają w środowisku, które promuje ich przeżycie i chroni je przed chemioterapią. Z tego powodu oś CXCL12/CXCR4 mogłaby być celem przyszłych terapii w celu zapobiegania nawrotom.

Według naszej wiedzy, nie ma danych dotyczących charakterystyki mikrośrodowiska szpiku kostnego w AML z mutacją NPM1. Charakterystyka MSC, jako najbardziej reprezentatywnych składników mikrośrodowiska szpiku kostnego, mogłaby być przydatna do identyfikacji specyficznych mechanizmów komórkowych, które mogłyby wyjaśnić wysoki wskaźnik nawrotów obserwowany u tych pacjentów.

Cele badania

Cel ogólny:

Scharakteryzować MSC szpiku kostnego osób dotkniętych AML NPM1mut jako możliwe nowe wskaźniki wyniku klinicznego pacjenta.

Szczegółowo, będzie badany fenotyp, profil genetyczny i funkcja MSC AML, oraz oceniana ich aktywność parakrynowa w celu zrozumienia mechanizmów, które promują oporność na terapię i występowanie nawrotów w AML NPM1mut na poziomie mikrośrodowiska szpiku kostnego. Aktywność parakrynowa MSC będzie oceniana poprzez badanie i charakterystykę mikropęcherzyków uwalnianych przez MSC po deprywacji.

Cel pierwszorzędowy:

Pierwszorzędowym celem tego badania jest wykrycie procentu MSC CD146+ w momencie diagnozy, ponieważ ta subpopulacja wydaje się być zaangażowana w tworzenie niszy LSC i chemiooporność. Opisano, że szpik kostny pacjentów z nawrotem wykazuje wyższy procent tej subpopulacji MSC w porównaniu z pacjentami osiągającymi remisję kliniczną. Celem jest wykazanie, że u pacjentów z AML NPM1mut występuje statystycznie istotna różnica w procentowym udziale MSC CD146+ (w momencie diagnozy) w porównaniu z MSC HD i MSC DC (MSC kontroli choroby: pacjenci z AML NPM1 wt).

Cel współpierwszorzędowy:

Porównanie procentu komórek CD146+ w momencie diagnozy i w różnych punktach czasowych (diagnoza, po indukcji, koniec leczenia, obserwacja, przed przeszczepem, nawrót) między pacjentami z nawrotem a pacjentami, którzy nie doświadczają nawrotu w całej populacji (AML NPM1mut i AML-NPM1wt)

Cele drugorzędowe:

1. Porównać subpopulację MSC CD146+ u pacjentów z AML NPM1mut i AML NPM1wt w każdym z predefiniowanych punktów czasowych.

2. Scharakteryzować MSC AML u pacjentów z AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi do definicji MSC (Dominici et al., 2006), będzie oceniana morfologia, zdolność do adhezji do plastiku, wydajność klonogeniczna, zdolność proliferacyjna i przejście do starzenia.

   Ekspresja markerów powierzchniowych CD105, CD73 i CD90 oraz brak CD45, CD34, CD14, CD19 i HLA-DR będzie oceniana poprzez znakowanie przeciwciałami monoklonalnymi i ocenę za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). Ekspresja CD146 i nestyny będzie oceniana na próbkach uzyskanych w specyficznych punktach czasowych. Zdolność MSC AML do różnicowania się w adipocyty i osteocyty będzie określana po stymulacji "in vitro" odpowiednimi czynnikami różnicowania.

3. Funkcjonalna charakterystyka MSC od pacjentów z AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Właściwości funkcjonalne MSC będą oceniane poprzez rozwój kokultury MSC AML w ustawieniu autologicznym (mononuklearne komórki krwi obwodowej pacjenta (PBMC)/MSC pacjenta) i allogenicznym (PBMC zdrowego dawcy/MSC pacjenta). Następnie będzie oceniany potencjał immunomodulujący, zdolność do generowania subpopulacji T, B i NK oraz regulacja osi CXCR4/CXCL12. Ponadto, cytokiny prozapalne i regulacyjne w supernatancie kultury będą kwantyfikowane.
4. Genomowa charakterystyka MSC u pacjentów z AML NPM1mut vs AML-NPM1wt Za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) z pomocą panelu genów często mutowanych w nowotworach mieloidalnych.

Cel trzeciorzędowy eksploracyjny

• Sortowanie subpopulacji MSC CD146+/nestyna+ do przyszłych badań kokultury in vitro
• Izolacja i charakterystyka MV uwalnianych przez MSC AML po deprywacji.
• Rozwój kultur PBMC od HD z MV w celu oceny ich aktywności parakrynowej.

Projekt badania Jest to pilotażowe, jednoośrodkowe, prospektywne, obserwacyjne, podłużne badanie in vitro

Uczestnicy i kryteria włączenia Dorośli pacjenci z nowo rozpoznaną ostrą białaczką szpikową zdiagnozowaną w Klinice Hematologicznej Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Kontrolami są zdrowi dawcy komórek macierzystych hematopoezy do przeszczepu szpiku kostnego zarejestrowani przez Oncoematologia Pediatrica, po podpisaniu świadomej zgody

Pobieranie próbek Ekspansja i analiza MSC szpiku kostnego w wybranych punktach czasowych (diagnoza, koniec indukcji, koniec konsolidacji, obserwacja, przed przeszczepieniem komórek macierzystych hematopoezy (HSCT), nawrót).

W tych samych punktach czasowych, próbka krwi obwodowej będzie pobierana. Każdy zaplanowany punkt czasowy reprezentuje rutynową praktykę kliniczną aspiracji szpiku kostnego i pobierania krwi.

Metody

Cele pierwszorzędowe i współpierwszorzędowe:

Sześćdziesięciu pacjentów z nowo rozpoznaną ostrą białaczką szpikową zdiagnozowaną w Klinice Hematologicznej Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo w Pawii będzie zarejestrowanych w ciągu trzech lat;

Cel pierwszorzędowy i współpierwszorzędowy:

Jako standardowa procedura, aspiracja szpiku kostnego zarejestrowanych pacjentów będzie pobierana w momencie diagnozy, końca indukcji, końca konsolidacji, obserwacji, przed i po HSCT, nawrocie.

MSC będą izolowane ze szpiku kostnego osób z AML NPM1mut i AML-NPM1wt, a następnie hodowane "in vitro'' z 5% lizowanym podłożem hodowlanym DMEM+ aż do starzenia.

Ekspresja markerów powierzchniowych CD146 i nestyny będzie oceniana poprzez wewnątrzkomórkowe znakowanie i późniejszą analizę za pomocą MFC FacsCanto II (BD). Procent MSC CD146+/nestyna+ w momencie wystąpienia choroby u pacjentów z AML NPM1mut będzie porównywany z procentem HD i kontroli choroby.

Cele drugorzędowe:

Charakterystyka MSC szpiku kostnego pacjentów poprzez ocenę wydajności klonogenicznej (jednostki tworzące kolonie, CFU-f). Tymczasem, zdolność proliferacyjna będzie oceniana pod względem skumulowanego podwojenia populacji (cPD). Starzenie MSC AML będzie definiowane jako czas, gdy liczba odzyskanych komórek jest mniejsza lub równa liczbie hodowanych komórek. Komórki starzejące się będą wykrywane za pomocą β-galaktozydazy.

Zdolność MSC AML do różnicowania się w adipocyty i osteocyty, napędzana dodaniem specyficznych czynników in vitro: barwnik Alizaryna czerwona specyficznie barwi krople lipidowe, podczas gdy barwnik fosfatazy alkalicznej podświetli obecność złogów wapnia, typowych dla osteocytów.

W tych samych punktach czasowych, próbka krwi obwodowej będzie pobierana, reszta standardowych analiz diagnostycznych przeprowadzanych podczas aktywności klinicznej. Z próbki PBMC będą ekstrahowane i używane w późniejszych eksperymentach immunomodulacji.

Właściwości funkcjonalne MSC AML będą oceniane po kokulturze z PBMC. Po trzech dniach inkubacji, zdolność MSC do modulacji proliferacji PBMC będzie analizowana poprzez włączenie tytrynowanej tymidyny. Wyniki będą porównywane z tymi uzyskanymi od MSC HD i kontroli choroby.

Po dziesięciu dniach inkubacji w tej samej kulturze, zdolność MSC AML do regulowania procentu subpopulacji limfocytów (limfocyty T i B oraz komórki NK) za pomocą MFC będzie oceniana, wraz z procentem regulatorowych komórek T poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego Foxp3, i ekspresją CXCR4 na powierzchni limfocytów pacjentów. Supernatanty kultur będą przechowywane i używane do dozowania CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 za pomocą ELISA.

DNA ekstrahowane z MSC osób z AML NPM1mut i AML NPM1wt będzie analizowane za pomocą niestandardowego panelu sekwencjonowania TruSight Myeloid Sequencing Panel 54 genów sekwencjonowanych przez Illumina MiSeq, razem z DNA ekstrahowanym z blastów białaczkowych tych samych pacjentów.

Cel trzeciorzędowy eksploracyjny Jeśli procent MSC CD146+/nestyna+ będzie odpowiedni, ta subpopulacja będzie sortowana i na niej będą przeprowadzane wyżej wymienione analizy.

MV będą izolowane poprzez ultrawirowanie i kwantyfikowane (NanoSight). Ekspresja markerów powierzchniowych MV będzie oceniana za pomocą zestawu MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) i cytometru przepływowego MacsQuant (Miltenyi).

Zawartość białkowa MV będzie oceniana za pomocą HPLC i spektrometrii mas.

Eksperymenty kokultury w obecności MV będą rozwijane.

Zbiór danych Dane będą rejestrowane w elektronicznej bazie danych. Pacjenci otrzymają kod identyfikacyjny, który zapewnia ich prywatność. Główny badacz będzie osobno przechowywał listę z danymi identyfikacyjnymi pacjenta i odpowiadającym kodem.

Obliczenie wielkości próby Dziewięćdziesiąt osób będzie zarejestrowanych (60 pacjentów: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt i 30 MSC HD). Z tą wielkością próby będzie możliwe wykrycie istotnego porównania post-hoc 2x2 (dwustronny błąd typu I alfa=0.017) w poziomach MSC nestyna+/CD146+ po jednoczynnikowej analizie wariancji, jeśli różnica między średnimi wynosi 85% wspólnego odchylenia standardowego. Przyjęto moc 80%.

Analiza statystyczna Zmienne jakościowe będą opisane jako bezwzględne i względne częstotliwości każdej kategorii. Zmienne ilościowe będą podsumowane jako średnia±odchylenie standardowe, lub przez medianę i zakres międzykwartylowy. Jeśli to konieczne, zostaną przyjęte transformacje logarytmiczne danych.

Analizy statystyczne będą przeprowadzane przy użyciu Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Analiza statystyczna dla punktu końcowego pierwszorzędowego Poziomy MSC nestyna+/CD146+ na początku będą porównywane między trzema grupami za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie porównaniami post-hoc Bonferroniego 2x2.

Analiza statystyczna dla punktu końcowego współpierwszorzędowego Związek między poziomami MSC nestyna+/CD146+ w różnych punktach czasowych a nawrotem będzie oceniany przez wspólny model danych podłużnych i przeżycia.

Analiza statystyczna dla punktów końcowych drugorzędowych

1. Porównanie według statusu mutacyjnego NPM1 będzie przeprowadzone przez dopasowanie wielopoziomowych mieszanych (z pacjentami traktowanymi jako efekt losowy) modeli liniowych lub logistycznych.
2. Interakcje między MSC a komórkami białaczkowymi będą analizowane przez dopasowanie wielopoziomowych mieszanych (z pacjentami traktowanymi jako efekt losowy) modeli liniowych lub logistycznych.
3. Test dokładny Fishera będzie wykonany w celu porównania pacjentów z AML NPM1mut vs AML-NPM1wt.

Analiza statystyczna dla punktów końcowych trzeciorzędowych eksploracyjnych Dla punktów końcowych trzeciorzędowych eksploracyjnych, zostaną zastosowane statystyki opisowe.

Świadoma zgoda Każdy pacjent otrzyma materiały informacyjne badania i zostanie uzyskana podpisana świadoma zgoda.

Ulotka informacyjna i świadoma zgoda wyjaśnią, że pacjent nie będzie poddawany dodatkowym pobraniom krwi i aspiracjom szpiku kostnego.