Mesenkymaaliset kantasolut NPM1-mutatoituneessa matalariskisessä akuutissa myelooisessa leukemiassa: tutkimus kasvaimen mikroympäristöstä ja sen vaikutuksesta lopputulokseen

Tausta Akutti myelooinen leukemia (AML) on heterogeeninen hematologinen pahanlaatuinen kasvain, jolle on ominaista klonaalinen laajeneminen ja erilaistumisen pysähtyminen myelooisten kantasolujen tasolla.

Vaikka nykyinen tietämys AML:n patogeneesistä on puutteellista, se on mahdollistanut potilaiden luokittelun eri ennusteellisiin ryhmiin ja johtanut personoitujen hoitostrategioiden kehittymiseen.

European Leukemia Net (ELN) luokittelee de novo AML:n suotuisiin, keskivaikeisiin ja haitallisiin riskiryhmiin geneettisten mutaatioiden ja kromosomipoikkeavuuksien perusteella. Erityisesti suotuisen riskiprofiilin potilaat ovat joko ydinbindausfaktorin uudelleenjärjestymien (CBF) läsnäolon, normaalin karyotyypin yhdessä nucleophosmin 1 (NPM1) mutaatioiden ja fms-related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) villityypin, NPM1 mutaatioiden ja FLT3-internaalisen tandemduplikaation alhaisella alleelisuhteella tai CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPα) bialleelisten mutaatioiden perusteella.

Huolimatta suotuisen riskiprofiilin, perinteisen kemoterapian jälkeen pitkäaikaista seurantaa saavilla potilailla on relapsiprosentit jopa 50 % NPM1-mutaatiolla varustetussa AML:ssä, 40 % CBF AML:ssä ja 44 % CEBPα bialleelisen mutaation omaavassa AML:ssä. Nämä tiedot korostavat tarpetta jatkotutkimuksille suotuisen riskin AML:ssä, jotta saataisiin lisätietoa patogeneettisista ja resistenssimekanismeista, mikä parantaisi potilasluokittelua. Lisäksi nämä näkemykset voisivat johtaa uusien terapeuttisten kohteiden löytämiseen.

NPM1 on yleisin mutaatio AML:ssä, mikä muodostaa noin 50–60 % de novo sytogeneettisesti normaalista AML:stä. Hiiri- ja in vivo -tutkimukset ovat osoittaneet, että NPM1-mutaatio edistää leukemogeneesiä ja myeloproliferaatiota, mutta ei yksinään riitä aiheuttamaan leukemiaa. Hematopoieettisten kantasolujen (HSC) esiintyvät mutaatiot voivat olla mahdollinen mekanismi, joka osallistuu leukemogeneesiin. Nämä mutaatiot koskevat pääasiassa hematopoieettisten kantasolujen tai esiasteiden epigeneettisiä modifikaattoreita, mikä johtaa niiden klonaaliseen laajenemiseen henkilöillä ilman selkeää hematologista sairautta. Tätä tilaa, jota kutsutaan klonaaliseksi hematopoeesiksi, pidetään preleukemiana tilana, joka voi edistää leukemogeneesiä ajavien mutaatioiden ilmaantumista. Todellakin, NPM1-mutaatiot liittyvät usein samanaikaisiin mutaatioihin, jotka koskevat signalointireittejä, DNA-metylaatiota, RNA-spleissausmekanismeja, kohosiinikompleksia, geenien transkriptiota ja kasvaimen tukahduttamisesta vastaavia geenejä.

Vaikka harvat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut samanaikaiset mutaatiot vaikuttavat negatiivisesti sairauden ennusteeseen, niiden todellisesta vaikutuksesta on edelleen kiistoja. Siksi mutaatioiden profiili yksinään ei voi täysin selittää joidenkin potilaiden kliinistä kulua tässä matalan riskin leukemia-ryhmässä; muut tekijät voivat vaikuttaa tämän AML-alaryhmän heterogeenisyyteen. Viime aikoina on tehty suuria ponnisteluita saadakseen tietoa leukemiseen hematopoieettiseen lokeroon, joka liittyy sairauden vastustuskykyyn ja relapsiin.

Hematopoieettiset kantasolut säätelevät kasvuaan, erilaistumistaan ja itseuusiutumisprosessejaan erityisessä luuytimen lokerossa vuorovaikutuksessa luuytimen mikroympäristön kanssa. Mikroympäristössä on solullinen kompartmentti, joka koostuu pääasiassa mesenkymaalikantasoluista (MSC), mutta myös osteoblasteista, endoteelisoluista ja makrofageista. Erityisesti MSC-alaryhmillä on erilaisia rooleja HSC-toiminnan säätelyssä.

Leukemiakantasolut ovat pieni leukemiasolujen alaryhmä, jolla on itseuusiutumiskyky ja kantasoluominaisuuksia. Määritelmän mukaan nämä solut voivat uudelleenkäynnistää leukemian, jos ne siirretään vastaanottajaan.

Luuytimen mikroympäristö vuorovaikuttaa myös leukemiakantasolujen (LSC) kanssa, muuttaen niiden kasvua, adheesio-ominaisuuksia, lepotilaa ja klonaalista laajenemista.

Samanaikaisesti tutkimukset ovat osoittaneet, että LSC:t voivat ohjelmoida uudelleen MSC:itä ja saada trofista tukea, suojelua oksidatiiviselta stressiltä ja suojaa toksisilta kemoterapeuttisilta aineilta, edistäen "leukemisen lokeron" muodostumista. Toisaalta luuytimen MSC:t vuorovaikuttavat LSC:iden kanssa, suoraan tai epäsuorasti, ja muuttavat LSC:iden kasvua, adheesio-ominaisuuksia, lepotilaa ja klonaalista laajenemista. Tuloksena MSC:t osallistuvat LSC:iden ylläpitoon. MSC:n muokkautuminen on leukemogeneesin itseuusiutumisstrategia, joka voisi selittää kliinisen heterogeenisyyden ja siten voisi olla mahdollinen ennusteellinen tekijä.

Useat tutkimukset ovat paljastaneet toiminnallisia muutoksia luuytimen MSC-tasolla AML-potilailla, kuten vähentynyttä kasvua, lisääntynyttä apoptoottista prosenttiosuutta ja pro-inflammatorista tilaa.

Vaikka luuytimen mikroympäristöllä näyttää olevan keskeinen rooli kemoresistenssin edistämisessä AML:ssä, on edelleen epäselvää, liittyvätkö nämä muutokset tai muut leukemian patogeneesiin.

AML-potilailla on muuttuneet MSC-ominaisuudet; erityisesti primitiivisten MSC:iden, määriteltynä CD146+/nestin+, määrä on vähentynyt verrattuna terveisiin verenluovuttajiin (HD). Nestin+ luuytimen MSC:t parantavat leukemiasolujen selviytymistä ja kemoresistenssiä stimuloimalla oksidatiivista fosforylaatiota ja siten lisäämällä energiantuotantoa. Tämä alaryhmä näyttää liittyvän sairauden kulkuun: relapsiin joutuneilla potilailla on suurempi prosenttiosuus CD146+/nestin+ MSC:itä verrattuna remissiossa oleviin potilaisiin.

Lisäksi muokatut MSC:t vuorovaikuttavat eri tavalla HSC:n ja LSC:n kanssa, estäen selektiivisesti normaalia hematopoeesia ja edistäen vastaavasti leukemogeneesiä ja kemoresistenssiä. Stroman välittämä leukemiasolujen suojelumechanismi on monimutkainen ja sisältää sytokiinien, kemokiinien, liukoisten tekijöiden ja mikrokukkasten (MV) verkoston, jotka edistävät LSC:iden kasvua. Todennäköinen toimintamekanismi on vuorovaikutus luuytimen stromasolujen ja LSC:iden välillä MSC:iden vapauttaman CXCL12:n ja sen sitoutumisen kautta LSC:iden pinnalla olevaan CXCR4-reseptoriin. Tarkemmin sanottuna leukemiasolut hyödyntävät CXCL12/CXCR4-akselia kotoutuakseen suojaavaan luuytimen lokeroon, joka on yleensä rajoitettu normaaleihin HSC:ihin. Tuloksena LSC:t asuvat ympäristössä, joka edistää niiden selviytymistä ja suojelee niitä kemoterapialta. Tästä syystä CXCL12/CXCR4-akselia voidaan tulevaisuudessa kohdistaa hoidoilla relapsien estämiseksi.

Tietojemme mukaan ei ole tietoja luuytimen mikroympäristön karakterisoinnista NPM1-mutatoituneessa AML:ssä. MSC:iden karakterisointi, luuytimen mikroympäristön edustavimpina komponentteina, voisi olla hyödyllistä erityisten solumechanismien tunnistamisessa, jotka voisivat selittää näissä potilaissa havaittua korkeaa relapsiprosenttia.

Tutkimuksen tavoitteet

Yleinen tavoite:

Karakterisoida AML NPM1mut-potilaiden luuytimen MSC:itä mahdollisina uusina indikaattoreina potilaan kliiniselle tulokselle.

Yksityiskohtaisesti tutkitaan AML-MSC:iden fenotyyppiä, geneettistä profiilia ja toimintaa, ja arvioidaan niiden parakriinistä aktiivisuutta ymmärtääkseen mekanismeja, jotka edistävät terapian resistenssiä ja relapsin ilmaantumista AML NPM1mut:ssa luuytimen mikroympäristön tasolla. MSC:iden parakriinistä aktiivisuutta arvioidaan tutkimalla ja karakterisoimalla MSC:iden vapauttamia mikrokukkasia riippumattomuuden jälkeen.

Ensisijainen tavoite:

Tämän tutkimuksen ensisijainen tavoite on CD146+ MSC:iden prosenttiosuuden havaitseminen diagnoosivaiheessa, koska tämä alaryhmä näyttää liittyvän LSC-lokeron luomiseen ja kemoresistenssiin. On kuvattu, että relapsiin joutuneiden potilaiden luuytimessä on suurempi prosenttiosuus tätä MSC-alaryhmää verrattuna kliiniseen remissioon joutuneisiin potilaisiin. Tavoitteena on osoittaa, että AML NPM1mut-potilailla on tilastollisesti merkitsevä ero CD146+ MSC-prosenttiosuudessa (diagnoosivaiheessa) verrattuna HD-MSC:ihin ja DC-MSC:ihin (sairauskontrolli MSC:t: AML-potilaat NPM1 wt).

Yhteensisijainen tavoite:

CD146+ solujen prosenttiosuuden vertailu diagnoosivaiheessa ja eri aikapisteissä (diagnoosi, induktion jälkeen, hoidon lopussa, seurannassa, ennen siirtoa, relapsi) relapsiin joutuneiden potilaiden ja ei-relapsiin joutuneiden potilaiden välillä koko populaatiossa (AML NPM1mut ja AML-NPM1wt)

Toissijaiset tavoitteet:

1. Vertaa MSC CD146+ alaryhmää AML NPM1mut- ja AML NPM1wt-potilailla jokaisessa ennalta määritellyssä aikapisteessä.

2. Karakterisoi AML-MSC:itä AML NPM1mut- vs AML NPM1wt-potilailla. Kansainvälisten ohjeiden mukaisesti MSC:iden määrittelyyn (Dominici et al., 2006), arvioidaan morfologia, kyky tarttua muoviin, klonogeeninen tehokkuus, proliferatiivinen kapasiteetti ja siirtyminen senesenssiin. Pintamarkkerien CD105, CD73 ja CD90 ilmentyminen ja CD45, CD34, CD14, CD19 ja HLA-DR puuttuminen arvioidaan monoklonaalisilla vasta-aineilla merkitsevällä ja moniparametrisella virtaussytometrialla (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). CD146 ja nestin ilmentymistä arvioidaan erityisissä aikapisteissä saaduista näytteistä. AML-MSC:iden kyky erilaistua adiposyyteiksi ja osteosyyteiksi määritetään "in vitro" -stimulaation jälkeen sopivilla erilaistumistekijöillä.

3. MSC:iden toiminnallinen karakterisointi AML NPM1mut- vs AML NPM1wt-potilailla. MSC:iden toiminnallisia ominaisuuksia arvioidaan kehittämällä autologinen (potilaan perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC)/potilaan MSC:t) ja allogeeninen (terveen verenluovuttajan PBMC/potilaan MSC:t) yhteiskulttuuri. Sitten arvioidaan immunomoduloiva potentiaali, kyky generoida T-, B- ja NK-alaryhmiä ja CXCR4/CXCL12-akselin säätely. Lisäksi kvantifioidaan pro-inflammatoriset ja säätelysytokiinit kulttuurin ylijäämässä.
4. MSC:iden genominen karakterisointi AML NPM1mut- vs AML-NPM1wt-potilailla käyttämällä next generation sequencing (NGS) -tekniikkaa apuna paneeli myeelisiin neoplasmioihin toistuvasti mutatoituneista geeneistä.

Kolmannen tason tutkiva tavoite

• CD146+/nestin+ MSC-alaryhmän erottelu tulevia in vitro -yhteiskulttuuritutkimuksia varten
• AML-MSC:iden vapauttamien MV:iden eristys ja karakterisointi riippumattomuuden jälkeen.
• HD-PBMC-kulttuurien kehittäminen MV:iden kanssa arvioidakseen niiden parakriinistä aktiivisuutta.

Tutkimussuunnittelu Tämä on pilottitutkimus, yksikeskuksinen prospektiivinen havainnointi-, longitudinaalinen, in vitro -tutkimus

Potilaat ja sisällyttämiskriteerit Aikuiset potilaat, joilla on uusi akutti myelooinen leukemia, diagnosoitu Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavian Clinica Ematologicassa.

Kontrollit ovat terveitä hematopoieettisten kantasolujen luovuttajia luuytimensiirtoon, jotka on rekrytoitu Oncoematologia Pediatrican kautta, informoidun suostumuksen allekirjoittamisen jälkeen

Näytteiden kerääminen Luuytimen MSC:iden laajentaminen ja analysointi valituissa aikapisteissä (diagnoosi, induktion lopussa, konsolidaation lopussa, seurannassa, ennen hematopoieettisten kantasolujen siirtoa (HSCT), relapsi). Samoina aikapisteinä kerätään perifeerinen verinäyte. Jokainen suunniteltu aikapiste edustaa tavallista kliinistä käytäntöä luuytimen aspirointiin ja verenkeräykseen.

Menetelmät

Ensisijaiset ja yhteensisijaiset tavoitteet:

Kuusikymmentä potilasta, joilla on uusi akutti myelooinen leukemia, diagnosoitu Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavian Clinica Ematologicassa, rekrytoidaan kolmen vuoden aikana;

Ensisijainen ja yhteensisijainen tavoite:

Vakiomenettelynä rekrytoitujen potilaiden luuytimen aspirointi suoritetaan diagnoosivaiheessa, induktion lopussa, konsolidaation lopussa, seurannassa, ennen ja jälkeen HSCT:n, relapsissa. MSC:t eristetään AML NPM1mut- ja AML-NPM1wt-potilaiden luuytimestä ja sitten viljellään "in vitro" 5 % lysatulla DMEM+ -viljelyalustalla senesenssiin asti. Pintamarkkerien CD146 ja nestin ilmentymistä arvioidaan solunsisäisellä merkitsevällä ja seuraavalla analyysillä MFC FacsCanto II (BD):llä. CD146+/nestin+ MSC:iden prosenttiosuutta sairauden puhkeamisvaiheessa AML NPM1mut-potilailla verrataan HD:n ja sairauskontrollien prosenttiosuuteen.

Toissijaiset tavoitteet:

Potilaiden luuytimen MSC:iden karakterisointi arvioimalla klonogeeninen tehokkuus (colony forming units, CFU-f). Samalla proliferatiivinen kapasiteetti arvioidaan kumulatiivisen populaation kaksinkertaistumisen (cPD) perusteella. AML-MSC:iden senesenssi määritellään ajankohdaksi, jolloin palautettujen solujen määrä on pienempi tai yhtä suuri kuin viljeltyjen solujen määrä. Senesentit solut havaitaan käyttämällä β-galaktosidaasia.

AML-MSC:iden kyky erilaistua adiposyyteiksi ja osteosyyteiksi, ohjattuna spesifisten tekijöiden lisäyksellä in vitro: Alizarin punainen väri värjää spesifisesti lipidipisaroita, kun taas alkalinen fosfataasiväri korostaa kalsiumkerrostumien läsnäoloa, tyypillistä osteosyyteille.

Samoina aikapisteinä kerätään perifeerinen verinäyte, joka on jäännös standardidiagnostisista analyyseistä, jotka suoritetaan kliinisessä toiminnassa. Näytteestä eristetään PBMC:t ja käytetään seuraavissa immunomodulaatiokokeissa.

AML-MSC:iden toiminnallisia ominaisuuksia arvioidaan yhteiskulttuurin jälkeen PBMC:iden kanssa. Kolmen päivän inkubaation jälkeen MSC:iden kyky moduloida PBMC:iden kasvua analysoidaan Titrated Thymidinen inkorporoinnin avulla. Tuloksia verrataan HD-MSC:istä ja sairauskontrollista saataviin tuloksiin.

Kymmenen päivän inkubaation jälkeen samassa kulttuurissa arvioidaan AML-MSC:iden kyky säädellä lymfosyyttialaryhmien (T- ja B-lymfosyytit ja NK-solut) prosenttiosuutta MFC:n avulla, yhdessä T-säätelysolujen prosenttiosuuden kanssa mittaamalla solunsisäinen Foxp3, ja CXCR4:n ilmentymistä potilaiden lymfosyyttien pinnalla. Kulttuurin ylijäämät varastoidaan ja käytetään CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2:n määritykseen ELISA-menetelmällä.

AML NPM1mut- ja AML NPM1wt-potilaiden MSC:istä eristetty DNA analysoidaan mukautetulla TruSight Myeloid Sequencing Panel -paneelilla, joka sisältää 54 geeniä, sekvensoituna Illumina MiSeq:llä, yhdessä samojen potilaiden leukemisten blasttien DNA:n kanssa.

Kolmannen tason tutkiva tavoite Jos CD146+/nestin+ MSC:iden prosenttiosuus on sopiva, tämä alaryhmä erotellaan ja siinä suoritetaan edellä mainitut analyysit.

MV:t eristetään ultrakeskittämällä ja kvantifioidaan (NanoSight). MV:n pintamarkkerien ilmentymistä arvioidaan MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) ja MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi) avulla.

MV:iden proteiinipitoisuus arvioidaan HPLC:llä ja massaspektrometrialla.

Kehitetään yhteiskulttuurikokeita MV:iden läsnä ollessa.

Datan kerääminen Data tallennetaan sähköiseen tietokantaan. Potilaat saavat tunnistuskoodin, joka varmistaa heidän yksityisyytensä. Päävastuuhenkilö pitää erillisessä listassa potilaan tunnistetiedot ja vastaavan koodin.

Näytekoko laskenta Yhdeksänkymmentä henkilöä rekrytoidaan (60 potilasta: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt ja 30 HD-MSC). Tällä näytekoollla on mahdollista havaita merkitsevä 2x2 post-hoc -vertailu (kaksisuuntainen tyyppi I virhe alpha=0.017) nestin+/CD146+ MSC-tasoissa yhden suunnan varianssianalyysin jälkeen, jos keskiarvojen ero on 85 % yhteisestä keskihajonnasta. Teho on otettu huomioon 80 %:na.

Tilastollinen analyysi Laadullisia muuttujia kuvataan absoluuttisina ja suhteellisina frekvensseinä jokaisessa kategoriassa. Kvantitatiivisia muuttujia tiivistetään keskiarvona ± keskihajonnana tai mediaanina ja interkvartiilialueena. Tarvittaessa käytetään datan log-muunnoksia.

Tilastolliset analyysit suoritetaan käyttäen Stata 17:ää (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Tilastollinen analyysi ensisijaiselle päätepisteelle Nestin+/CD146+ MSC-tasoja lähtötilanteessa verrataan kolmen ryhmän välillä yhden suunnan varianssianalyysillä, jota seuraa Bonferronin 2x2 post-hoc -vertailut.

Tilastollinen analyysi yhteensisijaiselle päätepisteelle Nestin+/CD146+ MSC-tasojen ja relapsin välistä assosiaatiota eri aikapisteissä arvioidaan yhteismallilla longitudinaalisille ja selviytymisdatalle.

Tilastollinen analyysi toissijaisille päätepisteille

1. Vertailu NPM1 mutaatioasteen mukaan suoritetaan sovittamalla monitasoisia sekoitettuja (potilaat käsitelty satunnaisvaikutuksina) lineaarisia tai logistisia malleja.
2. MSC:iden ja leukemisten solujen väliset vuorovaikutukset analysoidaan sovittamalla monitasoisia sekoitettuja (potilaat käsitelty satunnaisvaikutuksina) lineaarisia tai logistisia malleja.
3. Fisherin tarkka testi suoritetaan vertaillessa AML NPM1mut- ja AML-NPM1wt-potilaita.

Tilastollinen analyysi kolmannen tason tutkiville päätepisteille Kolmannen tason tutkiville päätepisteille käytetään kuvailevia tilastoja.

Informoitu suostumus Jokainen potilas saa tutkimuksen informatiivisen materiaalin ja allekirjoitetun informoidun suostumuksen lomakkeen. Tietolehtinen ja informoitu suostumus selventävät, että potilasta ei altisteta ylimääräisille verinäytteenottoille ja luuytimen aspiroinneille.