间充质干细胞在NPM1突变低危急性髓系白血病中的作用：肿瘤微环境及其对预后影响的研究

背景 急性髓系白血病（AML）是一种异质性血液系统恶性肿瘤，其特征为髓系祖细胞的克隆性扩增和分化阻滞。

尽管目前对AML发病机制的认识尚不完全，但已允许根据患者预后进行分层，并催生了个性化治疗策略。

欧洲白血病网（ELN）根据基因突变和染色体异常，将新发AML分为预后良好、中等和不良风险组。特别是，预后良好风险特征的患者表现为：存在核心结合因子重排（CBF）、核型正常伴有核磷蛋白1（NPM1）突变和fms相关受体酪氨酸激酶3（FLT3）野生型、NPM1突变和低等位基因比率的FLT3内部串联重复，或CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPα）的双等位基因突变。

尽管属于预后良好风险组，但传统化疗后长期随访的患者中，NPM1突变AML的复发率高达50%，CBF AML为40%，CEBPα双等位基因突变AML为44%。这些数据凸显了在预后良好风险AML中进一步研究的必要性，以获取更多关于致病和耐药机制的知识，从而改进患者分层。此外，这些见解可能有助于发现新的治疗靶点。

NPM1是AML中最常见的突变，约占新发细胞遗传学正常AML的50-60%。小鼠和体内研究已证明，NPM1突变促进白血病发生和骨髓增殖，但不足以诱发白血病。造血干细胞（HSCs）的预先存在突变可能是协同促进白血病发生的一种机制。这些突变主要涉及造血干细胞或祖细胞中的表观遗传修饰因子，导致其在无明显血液疾病的个体中克隆性扩增。这种称为克隆性造血的状态代表了一种前白血病状态，可能促进能够驱动白血病发生的突变出现。事实上，NPM1突变常与涉及信号通路、DNA甲基化、RNA剪接、粘连蛋白复合体、基因转录和肿瘤抑制基因的共现突变聚集。

尽管少数研究表明某些共现突变对疾病预后有负面影响，但其实际影响仍存在争议。因此，仅突变谱不能完全解释这组低风险白血病中某些患者的临床病程；其他因素可能在该AML亚组的异质性中起作用。最近，已做出重大努力以深入了解与疾病难治性和复发相关的白血病造血微环境。

造血干细胞通过与骨髓微环境的相互作用，在特定的骨髓微环境中调节其增殖、分化和自我更新过程。微环境有一个主要由间充质干细胞（MSCs）组成，但也包括成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞的细胞区室。特别是，MSC亚群在调节HSCs活性方面具有不同作用。

白血病干细胞是一小部分具有自我更新能力和干细胞特性的白血病细胞。根据定义，这些细胞如果植入受体宿主，可以重新引发白血病。

骨髓微环境同样与白血病干细胞（LSCs）相互作用，改变其增殖、粘附特性、静止状态和克隆性扩增。

同时，研究表明LSCs可以重编程MSCs并接受营养支持、氧化应激保护和有毒化疗药物的防护，促进“白血病微环境”的形成。另一方面，骨髓MSCs直接或间接与LSCs相互作用，并改变LSCs的增殖、粘附特性、静止状态和克隆性扩增。因此，MSCs有助于LSC的维持。MSC重塑是一种白血病发生的自我更新策略，可以解释临床异质性，因此可能是一个潜在的预后因素。

多项研究揭示了AML患者骨髓MSCs水平存在功能改变，如增殖减少、凋亡率增加和促炎状态。

尽管骨髓微环境似乎在促进AML化疗耐药中起关键作用，但这些改变或其他改变是否与白血病发病机制相关仍不清楚。

AML患者的MSCs特征发生改变；特别是，与健康供体（HD）相比，原始MSCs（定义为CD146+/nestin+）数量减少。Nestin+骨髓MSCs通过刺激氧化磷酸化从而增加能量产生，增强白血病细胞存活和化疗耐药。该亚群似乎与疾病病程相关：复发患者相对于缓解期受试者，CD146+/nestin+ MSCs百分比增加。

此外，修饰后的MSCs与HSC和LSC的相互作用不同，分别选择性抑制正常造血并促进白血病发生和化疗耐药。基质介导的白血病细胞保护机制复杂，涉及细胞因子、趋化因子、可溶性因子和促进LSCs增殖的微囊泡（MVs）网络。一个可能的作用机制是骨髓基质细胞通过MSCs释放CXCL12及其与LSCs表面CXCR4受体的结合而相互作用。更详细地说，白血病细胞利用CXCL12/CXCR4轴归巢到通常仅限于正常HSC的保护性骨髓微环境中。因此，LSCs驻留在一个促进其存活并保护其免受化疗影响的环境中。因此，CXCL12/CXCR4轴可能成为未来预防复发的治疗靶点。

据我们所知，目前没有关于NPM1突变AML中骨髓微环境特征的数据。MSCs作为骨髓微环境最具代表性的组成部分，其特征可能有助于识别特定的细胞机制，以解释这些患者中观察到的高复发率。

研究目标

总体目标：

表征NPM1突变AML患者的骨髓MSCs，作为患者临床结局可能的新指标。

具体而言，将研究AML-MSCs的表型、遗传谱和功能，并评估其旁分泌活性，以了解在骨髓微环境水平促进NPM1突变AML治疗耐药和复发发生的机制。MSCs的旁分泌活性将通过研究和表征MSCs在剥夺后释放的微囊泡来评估。

主要目标：

本研究的主要目标是检测诊断时CD146+ MSCs的百分比，因为该亚群似乎参与LSC微环境的形成和化疗耐药。已有描述显示，复发患者的骨髓中该MSC亚群百分比高于达到临床缓解的患者。目的是证明NPM1突变AML患者诊断时CD146+ MSC百分比与HD-MSCs和DC-MSCs（疾病对照MSCs：NPM1野生型AML患者）相比存在统计学显著差异。

共同主要目标：

比较整个群体（NPM1突变AML和NPM1野生型AML）中复发患者和未复发患者在诊断时和不同时间点（诊断、诱导后、治疗结束、随访、移植前、复发）的CD146+细胞百分比。

次要目标：

1. 在每个预定时间点比较NPM1突变AML和NPM1野生型AML患者的MSCs CD146+亚群。

2. 表征NPM1突变AML患者与NPM1野生型AML患者的AML-MSCs。根据MSCs定义的国际指南（Dominici等，2006），将评估形态、塑料粘附能力、克隆形成效率、增殖能力和向衰老的转变。通过单克隆抗体标记和多参数流式细胞术（MFC）（FacsCanto II，Becton Dickinson）评估表面标志物CD105、CD73和CD90的表达，以及CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR的缺失。CD146和nestin表达将在特定时间点获得的样本上进行评估。AML-MSCs向脂肪细胞和骨细胞分化的能力将在“体外”用适当分化因子刺激后确定。

3. NPM1突变AML患者与NPM1野生型AML患者MSCs的功能表征。将通过开发自体环境（患者外周血单个核细胞（PBMCs）/患者MSCs）和同种异体环境（健康供体PBMCs/患者MSCs）的AML-MSCs共培养来评估MSCs的功能特性。然后评估免疫调节潜力、生成T、B和NK亚群的能力以及CXCR4/CXCL12轴的调节。此外，将定量培养上清液中的促炎和调节性细胞因子。
4. 使用下一代测序（NGS）和一组在髓系肿瘤中反复突变的基因，对NPM1突变AML患者与NPM1野生型AML患者的MSCs进行基因组表征。

三级探索性目标

• 分选CD146+/nestin+ MSCs亚群，用于未来体外共培养研究
• 分离和表征AML-MSCs在剥夺后释放的MVs。
• 开发含有MVs的健康供体PBMCs培养，以评估其旁分泌活性。

研究设计 这是一项单中心前瞻性观察性纵向体外试验研究

受试者和纳入标准 在Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia的临床血液科诊断为新发急性髓系白血病的成年患者。

对照组为签署知情同意书后由儿科肿瘤血液科招募的用于骨髓移植的造血干细胞健康供体

样本收集 在选定时间点（诊断、诱导结束、巩固结束、随访、造血干细胞移植（HSCT）前、复发）扩增和分析骨髓MSCs。

在同一时间点，将收集外周血样本。每个计划时间点代表常规临床实践的骨髓穿刺和血液采集。

方法

主要和共同主要目标：

将在三年内招募60名在Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia的临床血液科诊断为新发急性髓系白血病的患者；

主要和共同主要目标：

作为标准程序，将在诊断、诱导结束、巩固结束、随访、HSCT前后、复发时收集招募患者的骨髓穿刺液。

将从NPM1突变AML和NPM1野生型AML受试者的骨髓中分离MSCs，然后用5%裂解DMEM+培养基“体外”培养直至衰老。

通过胞内标记和随后的MFC FacsCanto II（BD）分析评估表面标志物CD146和nestin的表达。将比较NPM1突变AML患者疾病发作时CD146+/nestin+ MSCs的百分比与健康供体和疾病对照的百分比。

次要目标：

通过评估克隆形成效率（集落形成单位，CFU-f）来表征患者的骨髓MSCs。同时，将以累积群体倍增（cPD）评估增殖能力。当回收细胞数量小于或等于培养细胞数量时，定义为AML-MSCs衰老。将使用β-半乳糖苷酶检测衰老细胞。

AML-MSCs在体外添加特定因子驱动下向脂肪细胞和骨细胞分化的能力：茜素红染料特异性染色脂滴，而碱性磷酸酶染料将突出显示骨细胞典型的钙沉积存在。

在同一时间点，将收集外周血样本，这是临床活动期间标准诊断分析的剩余部分。将从样本中提取PBMCs并用于后续免疫调节实验。

AML-MSCs的功能特性将在与PBMCs共培养后评估。孵育三天后，将通过氚标记胸苷掺入分析MSCs调节PBMCs增殖的能力。结果将与从HD-MSC和疾病对照获得的结果进行比较。

在同一培养中孵育十天后，将评估AML-MSCs通过MFC调节淋巴细胞亚群（T和B淋巴细胞及NK细胞）百分比的能力，以及通过测量胞内Foxp3评估调节性T细胞百分比，和患者淋巴细胞表面CXCR4的表达。培养上清液将储存并用于通过ELISA测定CXCL12、IL-6、IFN-γ、IL-10、PGE-2。

将从NPM1突变AML和NPM1野生型AML受试者的MSCs中提取的DNA，通过定制的TruSight Myeloid Sequencing Panel（54个基因，由Illumina MiSeq测序）进行分析，同时分析同一患者白血病原始细胞的DNA。

三级探索性目标 如果CD146+/nestin+ MSCs百分比合适，将分选该亚群并对其执行上述分析。

将通过超速离心分离MVs并定量（NanoSight）。将通过MACSPlex Exosomes Kit（Miltenyi）和MacsQuant Flow Cytometer（Miltenyi）评估MVs表面标志物的表达。

将通过HPLC和质谱评估MVs的蛋白质含量。

将开发存在MVs的共培养实验。

数据收集 数据将记录在电子数据库中。患者将获得一个确保其隐私的识别代码。主要研究者将单独保存一份包含患者识别数据和相应代码的列表。

样本量计算 将招募90名受试者（60名患者：30名NPM1突变AML，30名NPM1野生型AML和30名HD-MSCs）。通过该样本量，在进行单因素方差分析后，如果均值差为共同标准差的85%，将能够检测到nestin+/CD146+ MSCs水平的显著2x2事后比较（双侧I类错误alpha=0.017）。考虑了80%的检验效能。

统计分析 定性变量将描述为每个类别的绝对和相对频率。定量变量将总结为均值±标准差，或中位数和四分位距。必要时，将采用数据对数转换。

统计分析将使用Stata 17进行（StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.）

主要终点统计分析 基线时Nestin+/CD146+ MSCs水平将在三组之间通过单因素方差分析进行比较，随后进行Bonferroni的2x2事后比较。

共同主要终点统计分析 不同时间点nestin+/CD146+ MSCs水平与复发之间的关联将通过纵向和生存数据的联合模型评估。

次要终点统计分析

1. 根据NPM1突变状态的比较将通过拟合多水平混合（将患者视为随机效应）线性或逻辑模型进行。
2. MSCs与白血病细胞之间的相互作用将通过拟合多水平混合（将患者视为随机效应）线性或逻辑模型分析。
3. 将进行Fisher精确检验以比较NPM1突变AML患者与NPM1野生型AML患者。

三级探索性终点统计分析 对于三级探索性终点，将采用描述性统计。

知情同意 每位患者将收到研究信息材料，并获得签署的知情同意书。

信息传单和知情同意书将阐明患者不会接受额外的采血和骨髓穿刺。