Cellule Staminali Mesenchimali nella Leucemia Mieloide Acuta a Basso Rischio con Mutazione NPM1: uno Studio sul Microambiente Tumorale e sul suo Contributo all'Esito

Background La leucemia mieloide acuta (AML) è una neoplasia ematologica eterogenea caratterizzata dall'espansione clonale e dall'arresto della differenziazione delle cellule progenitrici mieloidi.

Sebbene incompleta, l'attuale conoscenza della patogenesi dell'AML ha permesso la stratificazione dei pazienti in diversi gruppi prognostici e ha portato all'emergere di strategie di trattamento personalizzate.

La European Leukemia Net (ELN) stratifica l'AML de novo in gruppi di rischio favorevole, intermedio e avverso secondo mutazioni genetiche e anomalie cromosomiche. In particolare, i pazienti con un profilo di rischio favorevole sono caratterizzati dalla presenza di riarrangiamenti del fattore legante il core (CBF), cariotipo normale con mutazioni della nucleofosmina 1 (NPM1) e fms related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) wild-type, mutazioni NPM1 e duplicazione interna in tandem di FLT3 con basso rapporto allelico, o mutazioni bialleliche in CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPα).

Nonostante il profilo di rischio favorevole, i pazienti in follow-up a lungo termine dopo chemioterapia convenzionale presentano tassi di recidiva fino al 50% nell'AML con mutazione NPM1, 40% nell'AML CBF e 44% nell'AML con mutazione biallelica CEBPα. Questi dati evidenziano la necessità di ulteriori indagini tra l'AML a rischio favorevole per acquisire maggiori conoscenze riguardo i meccanismi patogenetici e di resistenza, migliorando così la stratificazione dei pazienti. Inoltre, queste intuizioni potrebbero portare alla scoperta di nuovi bersagli terapeutici.

NPM1 è la mutazione più frequente nell'AML, rappresentando circa il 50-60% dell'AML de novo citogeneticamente normale. Studi murini e in vivo hanno dimostrato che la mutazione NPM1 promuove la leucemogenesi e la mieloproliferazione ma non è sufficiente a indurre la leucemia. Mutazioni preesistenti delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) possono essere un possibile meccanismo che coopera nella leucemogenesi. Queste mutazioni coinvolgono principalmente modificatori epigenetici nelle cellule staminali o progenitrici ematopoietiche, risultando nella loro espansione clonale in individui senza una evidente malattia ematologica. Questa condizione, denominata ematopoiesi clonale, rappresenta uno stato pre-leucemico che può promuovere l'emergere di mutazioni in grado di guidare la leucemogenesi. Infatti, le mutazioni NPM1 si raggruppano frequentemente con mutazioni co-occorrenti che coinvolgono geni delle vie di segnalazione, metilazione del DNA, splicing dell'RNA, complesso della coesina, trascrizione genica e soppressione tumorale.

Sebbene pochi studi abbiano dimostrato che alcune mutazioni co-occorrenti influenzino negativamente la prognosi della malattia, rimangono controversie sul loro reale impatto. Pertanto, il panorama mutazionale da solo non può spiegare completamente i decorsi clinici di alcuni pazienti in questo gruppo di leucemie a basso rischio; altri fattori possono svolgere un ruolo nell'eterogeneità di questo sottogruppo di AML. Recentemente, sono stati compiuti importanti sforzi per approfondire la nicchia ematopoietica leucemica, che è implicata nella refrattarietà e nella recidiva della malattia.

Le cellule staminali ematopoietiche regolano i loro processi di proliferazione, differenziazione e auto-rinnovamento in una specifica nicchia del midollo osseo, attraverso l'interazione con il microambiente del midollo osseo. Il microambiente ha un compartimento cellulare costituito principalmente da cellule staminali mesenchimali (MSC), ma anche osteoblasti, cellule endoteliali, macrofagi. In particolare, i sottogruppi di MSC hanno ruoli diversi nella regolazione dell'attività delle HSC.

Le cellule staminali leucemiche sono un piccolo sottogruppo di cellule leucemiche capaci di auto-rinnovamento e con proprietà staminali. Per definizione, queste cellule possono riavviare la leucemia se trapiantate in un ospite ricevente.

Il microambiente del midollo osseo interagisce anche con le cellule staminali leucemiche (LSC), alterando la loro proliferazione, proprietà di adesione, quiescenza ed espansione clonale.

Allo stesso tempo, studi hanno dimostrato che le LSC possono riprogrammare le MSC e ricevere supporto trofico, protezione dallo stress ossidativo e preservazione da agenti chemioterapici tossici, promuovendo la formazione di una "nicchia leucemica". D'altra parte, le MSC del midollo osseo interagiscono con le LSC, direttamente o indirettamente, e alterano la proliferazione, le proprietà di adesione, la quiescenza e l'espansione clonale delle LSC. Di conseguenza, le MSC contribuiscono al mantenimento delle LSC. Il rimodellamento delle MSC è una strategia di auto-rinnovamento della leucemogenesi che potrebbe spiegare l'eterogeneità clinica e quindi potrebbe essere un potenziale fattore prognostico.

Diversi studi hanno rivelato la presenza di alterazioni funzionali a livello delle MSC del midollo osseo in pazienti con AML, come diminuzione della proliferazione, aumento del tasso apoptotico e uno stato pro-infiammatorio.

Sebbene il microambiente del midollo osseo sembri svolgere un ruolo chiave nel promuovere la chemioresistenza nell'AML, se queste alterazioni o altre siano correlate alla patogenesi della leucemia rimane ancora poco chiaro.

I pazienti con AML hanno caratteristiche alterate delle MSC; in particolare, c'è una quantità ridotta di MSC primitive, definite come CD146+/nestin+, rispetto ai donatori sani (HD). Le MSC nestin+ del midollo osseo migliorano la sopravvivenza delle cellule leucemiche e la chemioresistenza stimolando la fosforilazione ossidativa e quindi aumentando la produzione di energia. Questa sottopopolazione sembra essere associata al decorso della malattia: i pazienti che recidivano hanno una percentuale aumentata di MSC CD146+/nestin+ rispetto ai soggetti in remissione.

Inoltre, le MSC modificate interagiscono diversamente con HSC e LSC, inibendo selettivamente l'ematopoiesi normale e promuovendo rispettivamente la leucemogenesi e la chemioresistenza. Il meccanismo di protezione stroma-mediata delle cellule leucemiche è complesso e coinvolge una rete di citochine, chemochine, fattori solubili e microvescicole (MV) che promuovono la proliferazione delle LSC. Un probabile meccanismo d'azione è l'interazione tra cellule stromali del midollo osseo e LSC attraverso il rilascio di CXCL12 da parte delle MSC e il suo legame al recettore CXCR4 sulla superficie delle LSC. Più in dettaglio, le cellule leucemiche sfruttano l'asse CXCL12/CXCR4 per homing in una nicchia protettiva del midollo osseo, solitamente riservata alle HSC normali. Di conseguenza, le LSC risiedono in un ambiente che promuove la loro sopravvivenza e le protegge dalla chemioterapia. Per questo motivo l'asse CXCL12/CXCR4 potrebbe essere bersagliato da future terapie per prevenire le recidive.

A nostra conoscenza, non ci sono dati riguardanti la caratterizzazione del microambiente del midollo osseo nell'AML mutata NPM1. La caratterizzazione delle MSC, come componenti più rappresentative del microambiente del midollo osseo, potrebbe essere utile per l'identificazione di specifici meccanismi cellulari che potrebbero spiegare l'alto tasso di recidiva osservato in questi pazienti.

Obiettivi dello studio

Obiettivo generale:

Caratterizzare le MSC del midollo osseo di soggetti affetti da AML NPM1mut come possibili nuovi indicatori dell'esito clinico del paziente.

In dettaglio, verranno studiati il fenotipo, il profilo genetico e la funzione delle MSC-AML, e verrà valutata la loro attività paracrina per comprendere i meccanismi che promuovono la resistenza alla terapia e l'occorrenza di recidiva nell'AML NPM1mut a livello del microambiente del midollo osseo. L'attività paracrina delle MSC sarà valutata attraverso lo studio e la caratterizzazione delle microvescicole rilasciate dalle MSC dopo deprivazione.

Obiettivo primario:

L'obiettivo primario di questo studio è la rilevazione della percentuale di MSC CD146+ alla diagnosi, poiché questa sottopopolazione sembra essere coinvolta nella creazione della nicchia delle LSC e nella chemioresistenza. È stato descritto che il midollo osseo di pazienti recidivati mostra una percentuale più alta di questa sottopopolazione di MSC rispetto ai pazienti in remissione clinica. Lo scopo è dimostrare che nei pazienti AML NPM1mut c'è una differenza statisticamente significativa nella percentuale di MSC CD146+ (alla diagnosi) rispetto alle MSC-HD e MSC-DC (MSC controllo malattia: pazienti AML NPM1 wt).

Obiettivo co-primario:

Confronto della percentuale di cellule CD146+ alla diagnosi e in diversi momenti (diagnosi, post induzione, fine trattamento, follow up, pre-trapianto, recidiva) tra pazienti recidivati e pazienti che non recidivano nell'intera popolazione (AML NPM1mut e AML-NPM1wt)

Obiettivi secondari:

1. Confrontare la sottopopolazione MSC CD146+ nei pazienti AML NPM1mut e AML NPM1wt in ogni momento predefinito.

2. Caratterizzare le MSC-AML in pazienti con AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Seguendo le linee guida internazionali per la definizione delle MSC (Dominici et al., 2006), verranno valutate la morfologia, la capacità di aderire alla plastica, l'efficienza clonogenica, la capacità proliferativa e la transizione alla senescenza.

   L'espressione dei marcatori di superficie CD105, CD73 e CD90 e la mancanza di CD45, CD34, CD14, CD19 e HLA-DR saranno valutate attraverso marcatura con anticorpi monoclonali e valutazione mediante citometria a flusso multiparametrica (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). L'espressione di CD146 e nestin sarà valutata sui campioni ottenuti in momenti specifici. La capacità delle MSC-AML di differenziarsi in adipociti e osteociti sarà determinata dopo stimolazione "in vitro" con i fattori di differenziazione appropriati.

3. Caratterizzazione funzionale delle MSC di pazienti AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Le proprietà funzionali delle MSC saranno valutate attraverso lo sviluppo di una co-coltura di MSC-AML in setting autologo (cellule mononucleate del sangue periferico del paziente (PBMC)/MSC del paziente) e allogenico (PBMC del donatore sano/MSC del paziente). Quindi verrà valutato il potenziale immunomodulante, la capacità di generare sottopopolazioni T, B e NK e la regolazione dell'asse CXCR4/CXCL12. Inoltre, verranno quantificate le citochine pro-infiammatorie e regolatorie nel surnatante della coltura.
4. Caratterizzazione genomica delle MSC in pazienti con AML NPM1mut vs AML-NPM1wt Utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS) con l'ausilio di un pannello di geni ricorrentemente mutati nelle neoplasie mieloidi.

Obiettivo terziario esplorativo

• Ordinamento della sottopopolazione MSC CD146+/nestin+ per future co-colture in studi in vitro
• Isolamento e caratterizzazione delle MV rilasciate dalle MSC-AML dopo deprivazione.
• Sviluppo di colture di PBMC da HD con MV per valutarne l'attività paracrina.

Disegno dello studio Questo è uno studio pilota prospettico osservazionale longitudinale in vitro, monocentrico

Soggetti e criteri di inclusione Pazienti adulti con esordio di Leucemia Mieloide Acuta diagnosticati presso la Clinica Ematologica della Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

I controlli sono donatori sani di cellule staminali ematopoietiche per trapianto di midollo osseo arruolati dall'Oncoematologia Pediatrica, previa firma del consenso informato

Raccolta dei campioni Espansione e analisi delle MSC del midollo osseo in momenti selezionati (diagnosi, fine induzione, fine consolidamento, follow-up, prima del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), recidiva).

Negli stessi momenti, verrà prelevato un campione di sangue periferico. Ogni momento pianificato rappresenta un prelievo di midollo osseo e raccolta di sangue di pratica clinica ordinaria.

Metodi

Obiettivi primari e co-primari:

Sessanta pazienti con esordio di Leucemia Mieloide Acuta diagnosticati presso la Clinica Ematologica della Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia saranno arruolati in tre anni;

Obiettivo primario e co-primario:

Come procedura standard, l'aspirato di midollo osseo dei pazienti arruolati sarà raccolto alla diagnosi fine induzione, fine consolidamento, follow-up, prima e dopo HSCT, recidiva.

Le MSC saranno isolate dal midollo osseo di soggetti AML NPM1mut e AML-NPM1wt, e poi coltivate "in vitro" con terreno di coltura DMEM+ lisato al 5% fino alla senescenza.

L'espressione dei marcatori di superficie CD146 e nestin sarà valutata attraverso marcatura intracitoplasmatica e successiva analisi mediante MFC FacsCanto II (BD). La percentuale di MSC CD146+/nestin+ all'esordio della malattia in pazienti con AML NPM1mut sarà confrontata con la percentuale di HD e controlli malattia.

Obiettivi secondari:

La caratterizzazione delle MSC del midollo osseo dei pazienti valutando l'efficienza clonogenica (unità formanti colonie, CFU-f). Nel frattempo, la capacità proliferativa sarà valutata in termini di raddoppiamento cumulativo della popolazione (cPD). La senescenza delle MSC-AML sarà definita come il momento in cui il numero di cellule recuperate è minore o uguale al numero di cellule coltivate. Le cellule senescenti saranno rilevate utilizzando β-galattosidasi.

La capacità delle MSC-AML di differenziarsi in adipociti e osteociti, guidata dall'aggiunta di fattori specifici in vitro: il colorante Alizarin red colora specificamente le goccioline lipidiche, mentre il colorante fosfatasi alcalina evidenzierà la presenza di depositi di calcio, tipici degli osteociti.

Negli stessi momenti, sarà raccolto un campione di sangue periferico, un residuo delle analisi diagnostiche standard eseguite durante l'attività clinica. Dal campione saranno estratte le PBMC e utilizzate nei successivi esperimenti di immunomodulazione.

Le proprietà funzionali delle MSC-AML saranno valutate dopo co-coltura con PBMC. Dopo tre giorni di incubazione, la capacità delle MSC di modulare la proliferazione delle PBMC sarà analizzata attraverso incorporazione di Timidina Tritiata. I risultati saranno confrontati con quelli ottenuti da MSC-HD e controlli malattia.

Dopo dieci giorni di incubazione nella stessa coltura, sarà valutata la capacità delle MSC-AML di regolare la percentuale delle sottopopolazioni linfocitarie (linfociti T e B e cellule NK) attraverso MFC, insieme alla percentuale di cellule T regolatorie attraverso la misurazione di Foxp3 intracitoplasmatico, e l'espressione di CXCR4 sulla superficie dei linfociti dei pazienti. I surnatanti della coltura saranno conservati e utilizzati per dosare CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 mediante ELISA.

Il DNA estratto dalle MSC di soggetti con AML NPM1mut e AML NPM1wt sarà analizzato attraverso un pannello personalizzato TruSight Myeloid Sequencing Panel di 54 geni sequenziati da Illumina MiSeq, insieme al DNA estratto dai blasti leucemici degli stessi pazienti.

Obiettivo terziario esplorativo Se la percentuale di MSC CD146+/nestin+ sarà adeguata, questa sottopopolazione sarà ordinata e verranno eseguite su di essa le analisi sopra menzionate.

Le MV saranno isolate mediante ultracentrifugazione e quantificate (NanoSight). L'espressione dei marcatori di superficie delle MV sarà valutata attraverso MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) e MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

Il contenuto proteico delle MV sarà valutato mediante HPLC e spettrometria di massa.

Saranno sviluppati esperimenti di co-coltura in presenza di MV.

Raccolta dati I dati saranno registrati in un database elettronico. I pazienti riceveranno un codice identificativo che garantisce la loro privacy. Il PI conserverà separatamente un elenco con i dati identificativi del paziente e il codice corrispondente.

Calcolo della dimensione del campione Novanta soggetti saranno arruolati (60 pazienti: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt e 30 MSC-HD). Con questa dimensione del campione sarà possibile rilevare un confronto post-hoc 2x2 significativo (errore di tipo I bilaterale alpha=0.017) nei livelli di MSC nestin+/CD146+ dopo analisi della varianza unidirezionale se la differenza tra le medie è l'85% della deviazione standard comune. È stata considerata una potenza dell'80%.

Analisi statistica Le variabili qualitative saranno descritte come frequenze assolute e relative di ciascuna categoria. Le variabili quantitative saranno riassunte come media±deviazione standard, o mediante mediana e intervallo interquartile. Se necessario, verranno adottate trasformazioni logaritmiche dei dati.

Le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Analisi statistica per l'endpoint primario I livelli di MSC nestin+/CD146+ al basale saranno confrontati tra tre gruppi con analisi della varianza unidirezionale, seguita da confronti post-hoc 2x2 di Bonferroni.

Analisi statistica per l'endpoint co-primario L'associazione tra livelli di MSC nestin+/CD146+ in diversi momenti e recidiva sarà valutata da un modello congiunto di dati longitudinali e di sopravvivenza.

Analisi statistica per gli endpoint secondari

1. Il confronto secondo lo stato mutazionale NPM1 sarà effettuato adattando modelli lineari o logistici misti multilivello (con pazienti trattati come effetto casuale).
2. Le interazioni tra MSC e cellule leucemiche saranno analizzate adattando modelli lineari o logistici misti multilivello (con pazienti trattati come effetto casuale).
3. Il test esatto di Fisher sarà eseguito per confrontare pazienti con AML NPM1mut vs AML-NPM1wt.

Analisi statistica per endpoint terziari esplorativi Per gli endpoint terziari esplorativi, saranno impiegate statistiche descrittive.

Consenso informato Ogni paziente riceverà il materiale informativo dello studio e sarà ottenuto il modulo di consenso informato firmato.

Un foglio informativo e il consenso informato chiariranno che il paziente non sarà sottoposto a prelievi di sangue aggiuntivi e aspirati di midollo osseo.