Mesenchymale stamceller i NPM1-mutert lavrisiko akutt myeloid leukemi: en studie av tumormikromiljøet og dets bidrag til utfallet

Bakgrunn Akutt myeloid leukemi (AML) er en heterogen hematologisk malignitet karakterisert ved klonal ekspansjon og differensieringsarrest av myeloide progenitorceller.

Selv om den er ufullstendig, har dagens kunnskap om AML-patogenesen muliggjort pasientstratifikasjon i ulike prognostiske grupper og har ført til fremveksten av personaliserte behandlingsstrategier.

European Leukemia Net (ELN) stratifiserer de novo AML i gunstige, intermediære og ugunstige risikogrupper i henhold til genetiske mutasjoner og kromosomale abnormaliteter. Spesielt er pasienter med et gunstig risikoprofil karakterisert enten ved tilstedeværelsen av core-binding factor-omlegginger (CBF), normal karyotype med nucleophosmin 1 (NPM1)-mutasjoner og fms-related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) villtype, NPM1-mutasjoner og FLT3-internal tandem duplikasjon med lav allelisk ratio, eller bialleliske mutasjoner i CCAAT/forsterker-bindende protein α (CEBPα).

Til tross for det gunstige risikoprofilet, har pasienter i langtids oppfølging etter konvensjonell kjemoterapi tilbakefallsrater på opptil 50% i AML med NPM1-mutasjon, 40% i CBF-AML, og 44% i AML med CEBPα biallelik mutasjon. Disse dataene understreker behovet for videre undersøkelser blant gunstig risiko AML for å få mer kunnskap om patogenetiske og resistensmekanismer, og dermed forbedre pasientstratifikasjon. Videre kunne disse innsiktene føre til oppdagelsen av nye terapeutiske mål.

NPM1 er den hyppigste mutasjonen i AML, og utgjør omtrent 50-60% av de novo cytogenetisk normal AML. Mus og in vivo-studier har vist at NPM1-mutasjon fremmer leukemogenese og myeloproliferasjon, men ikke er tilstrekkelig til å indusere leukemi. Eksisterende mutasjoner av hematopoietiske stamceller (HSCer) kan være en mulig mekanisme som samarbeider i leukemogenese. Disse mutasjonene involverer hovedsakelig epigenetiske modifikatorer i hematopoietiske stam- eller progenitorceller, noe som resulterer i deres klonale ekspansjon i individer uten en tydelig hematologisk sykdom. Denne tilstanden, kalt klonal hematopoiese, representerer en pre-leukemisk tilstand som kan fremme fremveksten av mutasjoner som kan drive leukemogenese. Faktisk klusterer NPM1-mutasjoner ofte med samtidige mutasjoner som involverer gener i signalveiene, DNA-metylering, RNA-splising, cohesin-komplekset, gentranskripsjon og tumorsuppresjon.

Selv om få studier har vist at noen samtidige mutasjoner negativt påvirker sykdomsprognosen, forblir det kontroverser om deres reelle påvirkning. Derfor kan mutasjonslandskapet alene ikke fullt ut forklare de kliniske forløpene til noen pasienter i denne gruppen av lavrisiko leukemier; andre faktorer kan spille en rolle i heterogeniteten til denne AML-under gruppen. Nylig har det blitt gjort store anstrengelser for å få innsikt i den leukemiske hematopoietiske nisjen, som er implisert i sykdomsrefraktæritet og tilbakefall.

Hematopoietiske stamceller regulerer sin proliferasjon, differensiering og selvfornyelsesprosesser i en spesifikk beinmargsnisje, gjennom interaksjon med BM-mikromiljøet. Mikromiljøet har en cellulær kompartement som hovedsakelig består av mesenkymale stamceller (MSCer), men også osteoblaster, endotelceller, makrofager. Spesielt har MSC-undergrupper forskjellige roller i reguleringen av HSC-aktivitet.

Leukemistamceller er en liten undergruppe av leukemiske celler som er i stand til selvfornyelse og med stamsegenskaper. Per definisjon kan disse cellene gjeninnlede leukemi hvis de transplanteres i en mottakervert.

BM-mikromiljøet samhandler også med leukemiske stamceller (LSCer), og endrer deres proliferasjon, adhesjonsegenskaper, kviesens og klonale ekspansjon.

Samtidig har studier vist at LSCer kan reprogrammere MSCene og motta trofisk støtte, beskyttelse mot oksidativt stress og bevaring fra toksiske kjemoterapeutiske midler, noe som fremmer dannelsen av en "leukemisk nisje". På den annen side samhandler BM-MSCene med LSCer, direkte eller indirekte, og endrer LSCers proliferasjon, adhesjonsegenskaper, kviesens og klonale ekspansjon. Som et resultat bidrar MSCene til LSC-vedlikehold. MSC-remodellering er en leukemogenese selvfornyelsesstrategi som kan forklare den kliniske heterogeniteten og dermed kan være en potensiell prognostisk faktor.

Flere studier har avdekket tilstedeværelsen av funksjonelle endringer på BM-MSC-nivået hos pasienter med AML, som redusert proliferasjon, økt apoptotisk hastighet og en pro-inflammatorisk tilstand.

Selv om BM-mikromiljøet ser ut til å spille en nøkkelrolle i å fremme kjemoresistens i AML, forblir det uklart om disse endringene eller andre er relatert til leukemipatogenese.

Pasienter med AML har endrede MSC-egenskaper; spesielt er det en redusert mengde primitive MSCer, definert som CD146+/nestin+, sammenlignet med friske donorer (HD). Nestin+ BM-MSCer forbedrer leukemisk celleoverlevelse og kjemoresistens ved å stimulere oksidativ fosforylering og dermed øke energiproduksjonen. Denne subpopulasjonen ser ut til å være assosiert med sykdomsforløpet: pasienter som får tilbakefall har en økt prosentandel av CD146+/nestin+ MSCer sammenlignet med individer i remisjon.

Videre samhandler modifiserte MSCer annerledes med HSC og LSC, og hemmer selektivt normal hematopoiese og fremmer leukemogenese og kjemoresistens, henholdsvis. Mekanismen for stromamediert beskyttelse av leukemiske celler er kompleks og involverer et nettverk av cytokiner, kemokiner, løselige faktorer og mikroveikler (MVer) som fremmer LSC-proliferasjon. En sannsynlig virkningsmekanisme er interaksjonen mellom BM-stromaceller og LSCer gjennom frigjøring av CXCL12 av MSCer og dets binding til CXCR4-reseptoren på overflaten av LSCer. Mer detaljert utnytter leukemiske celler CXCL12/CXCR4-aksen for homing i en beskyttende BM-nisje, som vanligvis er begrenset til normal HSC. Som et resultat oppholder LSCer seg i et miljø som fremmer deres overlevelse og beskytter dem mot kjemoterapi. Av denne grunn kan CXCL12/CXCR4-aksen være mål for fremtidige terapier for å forhindre tilbakefall.

Så vidt vi vet, er det ingen data angående karakteriseringen av BM-mikromiljøet i NPM1-mutert AML. Karakteriseringen av MSCer, som de mest representative komponentene av BM-mikromiljøet, kan være nyttig for identifikasjonen av spesifikke cellulære mekanismer som kan forklare den høye tilbakefallsraten observert hos disse pasientene.

Studiens mål

Generelt mål:

Å karakterisere BM-MSCene hos individer påvirket av AML NPM1mut som mulige nye indikatorer for pasientens kliniske utfall.

I detalj vil det studeres AML-MSCenes fenotype, genetiske profil og funksjon, og evaluere deres parakrine aktivitet for å forstå mekanismene som fremmer resistens mot terapi og tilbakefallsoppståelse i AML NPM1mut på nivået av beinmargsmikromiljøet. Den parakrine aktiviteten til MSCer vil bli vurdert gjennom studie og karakterisering av mikroveiklene frigjort av MSCer etter deprivasjon.

Primært mål:

Det primære målet med denne studien er påvisning av CD146+ MSC-prosent ved diagnose, da denne subpopulasjonen ser ut til å være involvert i LSC-nisjedannelse og kjemoresistens. Det er beskrevet at BM hos tilbakefallspasienter viser høyere prosentandel av denne MSC-subpopulasjonen sammenlignet med pasienter som gjennomgår klinisk remisjon. Målet er å demonstrere at det hos AML NPM1mut-pasienter er en statistisk signifikant forskjell i CD146+ MSC-prosent (ved diagnose) sammenlignet med HD-MSCer og DC-MSCer (sykdomskontroll MSCer: AML-pasienter NPM1 wt).

Ko-primært mål:

Sammenligning av prosentandelen av CD146+ celler ved diagnose og ved forskjellige tidspunkt (diagnose, etter induksjon, behandlingsslutt, oppfølging, før transplantasjon, tilbakefall) mellom tilbakefallspasienter og pasienter som ikke får tilbakefall i hele populasjonen (AML NPM1mut og AML-NPM1wt)

Sekundære mål:

1. Sammenligne MSC CD146+ subpopulasjonen i AML NPM1mut- og AML NPM1wt-pasienter ved hvert forhåndsdefinerte tidspunkt.

2. Karakterisere AML-MSCer hos pasienter med AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Etter de internasjonale retningslinjene for definisjon av MSCer (Dominici et al., 2006), vil det bli evaluert morfologien, evnen til å feste seg til plast, den klonogene effektiviteten, den proliferative kapasiteten og overgangen til senescens.

   Uttrykket av overflatemarkørene CD105, CD73 og CD90 og fraværet av CD45, CD34, CD14, CD19 og HLA-DR vil bli evaluert gjennom merking med monoklonale antistoffer og vurdering ved hjelp av multiparametrisk flytsytometri (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). CD146- og nestin-uttrykk vil bli vurdert på prøvene innhentet på spesifikke tidspunkt. AML-MSCenes evne til å differensiere til adipocytter og osteocytter vil bli bestemt etter "in vitro"-stimulering med de passende differensieringsfaktorene.

3. Funksjonell karakterisering av MSCer fra AML NPM1mut vs AML NPM1wt-pasienter. MSCers funksjonelle egenskaper vil bli evaluert gjennom utvikling av en ko-kultur av AML-MSCer i autolog setting (pasientens perifere blod mononukleære celler (PBMCer)/pasientens MSCer) og allogen en (frisk donors PBMCer/pasientens MSCer). Deretter vil det bli vurdert det immunmodulerende potensialet, evnen til å generere T-, B- og NK-subpopulasjoner og reguleringen av CXCR4/CXCL12-aksen. Videre vil de pro-inflammatoriske og regulatoriske cytokinene i kulturens supernatant bli kvantifisert.
4. Genomisk karakterisering av MSCene hos pasienter med AML NPM1mut vs AML-NPM1wt Ved å bruke neste generasjons sekvensering (NGS) med hjelp av et panel av gener som gjentatte ganger muteres i myeløide neoplasi.

Tertiært eksplorativt mål

• Sortering av CD146+/nestin+ MSC-subpopulasjonen for fremtidige ko-kultur in vitro-studier
• Isolasjon og karakterisering av MVer frigjort av AML-MSCer etter deprivasjon.
• Utvikling av kulturer av PBMCer fra HD med MVer for å evaluere deres parakrine aktivitet.

Studiedesign Dette er en pilot enkelt-senter prospektiv observasjons-, longitudinell, in vitro-studie

Deltakere og inklusjonskriterier Voksne pasienter med nyoppstått akutt myeloid leukemi diagnostisert ved Clinica Ematologica ved Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Kontrollene er friske donorer av hematopoietiske stamceller for beinmargstransplantasjon rekruttert av Oncoematologia Pediatrica, etter signering av informert samtykke

Innsamling av prøver Ekspansjon og analyse av beinmargens MSCer ved utvalgte tidspunkt (diagnose, slutten av induksjon, slutten av konsolidering, oppfølging, før hematopoietisk stamcelle transplantasjon (HSCT), tilbakefall).

Ved samme tidspunkt vil en perifer blodprøve bli samlet inn. Hvert planlagte tidspunkt representerer en ordinær klinisk praksis beinmargsaspirasjon og blodinnsamling.

Metoder

Primære og ko-primære mål:

Seksti pasienter med nyoppstått akutt myeloid leukemi diagnostisert ved Clinica Ematologica ved Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo i Pavia vil bli rekruttert over tre år;

Primært og ko-primært mål:

Som standardprosedyre vil beinmargsaspiratet av de rekrutterte pasientene bli samlet inn ved diagnose slutten av induksjon, slutten av konsolidering, oppfølging, før og etter HSCT, tilbakefall.

MSCene vil bli isolert fra beinmargen til AML NPM1mut- og AML-NPM1wt-individer, og deretter kultivert "in vitro" med 5% lyst DMEM+ kulturmedium til senescens.

Uttrykket av overflatemarkørene CD146 og nestin vil bli evaluert gjennom intracellulær merking og påfølgende analyse gjennom MFC FacsCanto II (BD). Prosentandelen av CD146+/nestin+ MSCer ved sykdomsutbrudd hos pasienter med AML NPM1mut vil bli sammenlignet med prosentandelen av HD og sykdomskontroller.

Sekundære mål:

Karakteriseringen av pasientenes BM-MSCer ved å evaluere den klonogene effektiviteten (kolonidannende enheter, CFU-f). I mellomtiden vil den proliferative kapasiteten bli vurdert i form av kumulativ populasjonsdobbling (cPD). Senescens av AML-MSCer vil bli definert som tiden når antallet celler gjenopprettet er mindre enn eller lik antallet celler kultivert. Senescente celler vil bli påvist ved bruk av β-galaktosidase.

Evnen til AML-MSCer til å differensiere til adipocytter og osteocytter, drevet av tilsetning av spesifikke faktorer in vitro: Alizarin rødt fargestoff farger spesifikt lipid-dropler, mens det alkaliske fosfat-fargestoffet vil fremheve tilstedeværelsen av kalsiumavsetninger, typisk for osteocytter.

Ved samme tidspunkt vil en perifer blodprøve bli samlet inn, en rest av de standard diagnostiske analysene utført under klinisk aktivitet. Fra prøven vil PBMCer bli ekstrahert og brukt i de påfølgende immunmodulasjonseksperimentene.

AML-MSCenes funksjonelle egenskaper vil bli evaluert etter ko-kultur med PBMCer. Etter tre dagers inkubasjon vil MSCenes evne til å modulere PBMCers proliferasjon bli analysert gjennom inkorporering av Titrert Thymidin. Resultatene vil bli sammenlignet med de oppnådd fra HD-MSC og sykdomskontroller.

Etter ti dagers inkubasjon i samme kultur vil kapasiteten til AML-MSCer til å regulere prosentandelen av lymfocyt-subpopulasjonene (T- og B-lymfocytter og NK-celler) gjennom MFC bli evaluert, sammen med prosentandelen av regulatoriske T-celler gjennom måling av intracellulært Foxp3, og uttrykket av CXCR4 på overflaten av pasientenes lymfocytter. Kulturens supernatants vil bli lagret og brukt til å dose CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 ved hjelp av ELISA.

DNA ekstrahert fra MSCene hos individer med AML NPM1mut og AML NPM1wt vil bli analysert gjennom en tilpasset TruSight Myeloid Sequencing Panel av 54 gener sekvensert av Illumina MiSeq, sammen med DNA ekstrahert fra leukemiske blaster fra de samme pasientene.

Tertiært eksplorativt mål Hvis prosentandelen CD146+/nestin+ MSCer vil være egnet, vil denne subpopulasjonen bli sortert og de ovennevnte analysene på den vil bli utført.

MVene vil bli isolert gjennom ultrasentrifugering og kvantifisert (NanoSight). Uttrykket av MVer overflatemarkører vil bli vurdert gjennom MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) og MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

Proteininnholdet i MVer vil bli evaluert gjennom HPLC og massespektrometri.

Ko-kultureksperimenter i nærvær av MVer vil bli utviklet.

Datainnsamling Data vil bli registrert i en elektronisk database. Pasienter vil motta en identifikasjonskode som sikrer deres personvern. PI vil oppbevare separat en liste med pasientens identifikasjonsdata og den tilsvarende koden.

Utregning av utvalgsstørrelse Nitti individer vil bli rekruttert (60 pasienter: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt og 30 HD-MSCer). Med denne utvalgsstørrelsen vil det være mulig å oppdage en signifikant 2x2 post-hoc sammenligning (tosidig type I feil alfa=0,017) i nestin+/CD146+ MSC-nivåer etter en-veis variansanalyse hvis forskjellen mellom gjennomsnittene er 85% av den felles standardavviket. En styrke på 80% har blitt vurdert.

Statistisk analyse Kvalitative variabler vil bli beskrevet som absolutte og relative frekvenser av hver kategori. Kvantitative variabler vil bli oppsummert som gjennomsnitt±standardavvik, eller ved median og interkvartilområde. Om nødvendig vil log-transformasjoner av data bli tatt i bruk.

Statistiske analyser vil bli utført ved bruk av Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Statistisk analyse for primært endepunkt Nestin+/CD146+ MSC-nivåer ved baseline vil bli sammenlignet mellom tre grupper med en-veis variansanalyse, etterfulgt av Bonferronis 2x2 post-hoc sammenligninger.

Statistisk analyse for ko-primært endepunkt Assosiasjonen mellom nestin+/CD146+ MSC-nivåer ved forskjellige tidspunkt og tilbakefall vil bli evaluert av en felles modell av longitudinelle og overlevelsesdata.

Statistisk analyse for sekundære endepunkter

1. Sammenligningen i henhold til NPM1 mutasjonsstatus vil bli utført ved å tilpasse flernivå blandede (med pasienter behandlet som tilfeldig effekt) lineære eller logistiske modeller.
2. Interaksjonene mellom MSCer og leukemiske celler vil bli analysert ved å tilpasse flernivå blandede (med pasienter behandlet som tilfeldig effekt) lineære eller logistiske modeller.
3. Fishers eksakte test vil bli utført for å sammenligne pasienter med AML NPM1mut vs AML-NPM1wt.

Statistisk analyse for tertiære eksplorative endepunkter For tertiære eksplorative endepunkter vil beskrivende statistikk bli benyttet.

Informert samtykke Hver pasient vil motta studiens informasjonsmateriale og signert informert samtykke skjema vil bli innhentet.

Et informasjonsark og informert samtykke vil klargjøre at pasienten ikke vil bli utsatt for ytterligere blodprøvetaking og beinmargsaspirasjoner.