Mesenchymale Stamcellen in NPM1-gemuteerd Laagrisico Acute Myeloïde Leukemie: een Onderzoek naar de Tumormicro-omgeving en de Bijdrage ervan aan de Uitkomst

Achtergrond Acute myeloïde leukemie (AML) is een heterogene hematologische maligniteit die wordt gekenmerkt door clonale expansie en differentiatie-arrest van myeloïde voorlopercellen.

Hoewel onvolledig, heeft de huidige kennis van de pathogenese van AML patiëntstratificatie in verschillende prognostische groepen mogelijk gemaakt en heeft geleid tot de opkomst van gepersonaliseerde behandelstrategieën.

Het European Leukemia Net (ELN) stratificeert de novo AML in gunstige, intermediaire en ongunstige risicogroepen volgens genetische mutaties en chromosomale afwijkingen. In het bijzonder worden patiënten met een gunstig risicoprofiel gekenmerkt door de aanwezigheid van core-binding factor herschikkingen (CBF), normaal karyotype met nucleophosmin 1 (NPM1) mutaties en fms related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) wild-type, NPM1 mutaties en FLT3-internal tandem duplicatie met lage allelische ratio, of biallele mutaties in CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPα).

Ondanks het gunstige risicoprofiel hebben patiënten in langdurige follow-up na conventionele chemotherapie recidiefpercentages tot 50% in AML met NPM1 mutatie, 40% in CBF AML, en 44% in AML met CEBPα biallele mutatie. Deze gegevens benadrukken de noodzaak van verder onderzoek onder gunstig-risico AML om meer kennis te vergaren over de pathogenetische en resistentiemechanismen, waardoor patiëntstratificatie kan worden verbeterd. Bovendien zouden deze inzichten kunnen leiden tot de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen.

NPM1 is de meest frequente mutatie in AML, goed voor ongeveer 50-60% van de novo cytogenetisch normale AML. Muizen- en in vivo studies hebben aangetoond dat NPM1 mutatie leukemogenese en myeloproliferatie bevordert, maar niet voldoende is om leukemie te induceren. Pre-existente mutaties van hematopoëtische stamcellen (HSC's) kunnen een mogelijk mechanisme zijn dat samenwerkt in leukemogenese. Deze mutaties betreffen voornamelijk epigenetische modificatoren in hematopoëtische stam- of voorlopercellen, wat resulteert in hun clonale expansie in individuen zonder duidelijke hematologische ziekte. Deze aandoening, clonale hematopoëse genaamd, vertegenwoordigt een pre-leukemische staat die de opkomst van mutaties die leukemogenese kunnen aansturen kan bevorderen. Inderdaad, NPM1 mutaties clusteren vaak met gelijktijdig voorkomende mutaties in genen van signaalroutes, DNA-methylering, RNA-splicing, cohesinecomplex, gentranscriptie en tumorsuppressie.

Hoewel enkele studies hebben aangetoond dat sommige gelijktijdige mutaties de ziekteprognose negatief beïnvloeden, blijven er controverses over hun werkelijke impact. Daarom kan het mutatielandschap alleen niet volledig de klinische verloop van sommige patiënten in deze groep laag-risico leukemieën verklaren; andere factoren kunnen een rol spelen in de heterogeniteit van deze AML-subgroep. Recentelijk zijn er grote inspanningen geleverd om inzicht te krijgen in de leukemische hematopoëtische niche, die betrokken is bij ziekterefractariteit en recidief.

Hematopoëtische stamcellen reguleren hun proliferatie, differentiatie en zelfvernieuwing in een specifiek beenmergniche, via interactie met de BM-micro-omgeving. De micro-omgeving heeft een cellulair compartiment dat voornamelijk bestaat uit mesenchymale stamcellen (MSC's), maar ook osteoblasten, endotheelcellen, macrofagen. In het bijzonder hebben MSC-subgroepen verschillende rollen in de regulatie van HSC-activiteit.

Leukemie stamcellen zijn een kleine subgroep van leukemische cellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en met stamcel-eigenschappen. Per definitie kunnen deze cellen leukemie opnieuw initiëren als ze worden getransplanteerd in een ontvangende gastheer.

De BM-micro-omgeving interageert ook met leukemische stamcellen (LSC's), waardoor hun proliferatie, adhesie-eigenschappen, quiescentie en clonale expansie worden veranderd.

Tegelijkertijd hebben studies aangetoond dat LSC's de MSC's kunnen herprogrammeren en trofische ondersteuning, bescherming tegen oxidatieve stress en bescherming tegen toxische chemotherapeutische middelen kunnen ontvangen, wat de vorming van een "leukemische niche" bevordert. Aan de andere kant interageren de BM MSC's, direct of indirect, met LSC's en veranderen ze de proliferatie, adhesie-eigenschappen, quiescentie en clonale expansie van LSC's. Als gevolg daarvan dragen de MSC's bij aan het onderhoud van LSC. MSC-remodellering is een leukemogenese zelfvernieuwingsstrategie die de klinische heterogeniteit zou kunnen verklaren en dus een potentiële prognostische factor zou kunnen zijn.

Verschillende studies hebben de aanwezigheid van functionele veranderingen op het BM-MSC-niveau bij patiënten met AML onthuld, zoals verminderde proliferatie, verhoogde apoptose-snelheid en een pro-inflammatoire staat.

Hoewel de BM-micro-omgeving een sleutelrol lijkt te spelen bij het bevorderen van chemoresistentie in AML, blijft het onduidelijk of deze veranderingen of andere gerelateerd zijn aan leukemiepathogenese.

Patiënten met AML hebben veranderde MSC-kenmerken; in het bijzonder is er een verminderde hoeveelheid primitieve MSC's, gedefinieerd als CD146+/nestin+, vergeleken met gezonde donoren (HD). Nestin+ BM-MSC's verbeteren de overleving en chemoresistentie van leukemische cellen door oxidatieve fosforylering te stimuleren en zo de energieproductie te verhogen. Deze subpopulatie lijkt geassocieerd te zijn met het ziekteverloop: patiënten die recidiveren hebben een verhoogd percentage CD146+/nestin+ MSC's ten opzichte van personen in remissie.

Bovendien interageren gemodificeerde MSC's anders met HSC en LSC, waarbij ze selectief normale hematopoëse remmen en respectievelijk leukemogenese en chemoresistentie bevorderen. Het mechanisme van stroma-gemedieerde bescherming van leukemische cellen is complex en omvat een netwerk van cytokines, chemokines, oplosbare factoren en microvesikels (MV's) die LSC-proliferatie bevorderen. Een waarschijnlijk werkingsmechanisme is de interactie tussen BM stromale cellen en LSC's via de afgifte van CXCL12 door MSC's en de binding aan de CXCR4-receptor op het oppervlak van LSC's. Meer in detail maken leukemische cellen gebruik van de CXCL12/CXCR4-as voor homing in een beschermende BM-niche, die normaal gesproken beperkt is tot normale HSC. Als gevolg daarvan verblijven LSC's in een omgeving die hun overleving bevordert en hen beschermt tegen chemotherapie. Om deze reden zou de CXCL12/CXCR4-as een doelwit kunnen zijn voor toekomstige therapieën om recidieven te voorkomen.

Voor zover wij weten, zijn er geen gegevens over de karakterisering van de BM-micro-omgeving in NPM1-gemuteerde AML. De karakterisering van MSC's, als de meest representatieve componenten van de BM-micro-omgeving, zou nuttig kunnen zijn voor de identificatie van specifieke cellulaire mechanismen die de hoge recidiefpercentages bij deze patiënten zouden kunnen verklaren.

Doelstellingen van de studie

Algemeen doel:

Het karakteriseren van de BM-MSC's van personen met AML NPM1mut als mogelijke nieuwe indicatoren van het klinische resultaat van de patiënt.

In detail zal het fenotype, genetisch profiel en functie van AML-MSC's worden bestudeerd, en zal hun paracriene activiteit worden geëvalueerd om de mechanismen te begrijpen die resistentie tegen therapie en recidief optreden bevorderen in AML NPM1mut op het niveau van de beenmerg-micro-omgeving. De paracriene activiteit van MSC's zal worden beoordeeld door de studie en karakterisering van de microvesikels die door MSC's worden vrijgegeven na deprivatie.

Primair doel:

Het primaire doel van deze studie is de detectie van het percentage CD146+ MSC's bij diagnose, aangezien deze subpopulatie betrokken lijkt te zijn bij de LSC-nichevorming en chemo-resistentie. Het is beschreven dat het BM van recidiverende patiënten een hoger percentage van deze MSC-subpopulatie vertoont vergeleken met patiënten die klinische remissie ondergaan. Het doel is de demonstratie dat bij AML NPM1mut patiënten er een statistisch significant verschil is in CD146+ MSC-percentage (bij diagnose) vergeleken met HD-MSC's en DC-MSC's (ziektecontrole MSC's: AML patiënten NPM1 wt).

Co-primair doel:

Vergelijking van het percentage CD146+ cellen bij diagnose en op verschillende tijdstippen (diagnose, na inductie, einde behandeling, follow-up, pre-transplantatie, recidief) tussen recidiverende patiënten en patiënten die niet recidiveren in de hele populatie (AML NPM1mut en AML-NPM1wt)

Secundaire doelstellingen:

1. Vergelijk de MSC's CD146+ subpopulatie in AML NPM1mut en AML NPM1wt patiënten op elk vooraf gedefinieerd tijdstip.

2. Karakteriseer AML-MSC's in patiënten met AML NPM1mut versus AML NPM1wt. Volgens de internationale richtlijnen voor de definitie van MSC's (Dominici et al., 2006), zullen de morfologie, het vermogen om aan plastic te hechten, de clonogene efficiëntie, de proliferatieve capaciteit en de overgang naar senescentie worden geëvalueerd.

   De expressie van oppervlaktemarkers CD105, CD73 en CD90 en het ontbreken van CD45, CD34, CD14, CD19 en HLA-DR zullen worden geëvalueerd door middel van labelen met monoklonale antilichamen en beoordeling via multiparametrische flowcytometrie (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). CD146 en nestin expressie zullen worden beoordeeld op de monsters verkregen op specifieke tijdstippen. Het vermogen van AML-MSC's om te differentiëren in adipocyten en osteocyten zal worden bepaald na "in vitro" stimulatie met de juiste differentiatiefactoren.

3. Functionele karakterisering van MSC's van AML NPM1mut versus AML NPM1wt patiënten. Functionele eigenschappen van MSC's zullen worden geëvalueerd door de ontwikkeling van een co-cultuur van AML-MSC's in de autologe setting (perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) van de patiënt/MSC's van de patiënt) en allogene setting (PBMC's van gezonde donor/MSC's van de patiënt). Vervolgens zal het immunomodulerende potentieel, het vermogen om T-, B- en NK-subpopulaties te genereren en de regulatie van de CXCR4/CXCL12-as worden beoordeeld. Bovendien zullen de pro-inflammatoire en regulerende cytokines in het supernatant van de cultuur worden gekwantificeerd.
4. Genomische karakterisering van de MSC's in patiënten met AML NPM1mut versus AML-NPM1wt Door gebruik te maken van next generation sequencing (NGS) met behulp van een panel van genen die vaak gemuteerd zijn in myeloïde neoplasmen.

Tertiair exploratief doel

• Sorteren van de CD146+/nestin+ MSC's subpopulatie voor toekomstige co-cultuur in vitro studies
• Isolatie en karakterisering van de MV's vrijgegeven door AML-MSC's na deprivatie.
• Ontwikkeling van culturen van PBMC's van HD met MV's om hun paracriene activiteit te evalueren.

Studieontwerp Dit is een pilot single center prospectief observationeel, longitudinaal, in vitro onderzoek

Proefpersonen en inclusiecriteria Volwassen patiënten met nieuw ontstane Acute Myeloïde Leukemie gediagnosticeerd aan de Clinica Ematologica van de Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

De controles zijn gezonde donoren van hematopoëtische stamcellen voor beenmergtransplantatie aangemeld door Oncoematologia Pediatrica, na ondertekening van de geïnformeerde toestemming

Verzameling van monsters Expansie en analyse van de beenmerg MSC's op geselecteerde tijdstippen (diagnose, einde inductie, einde consolidatie, follow-up, voor hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT), recidief).

Op dezelfde tijdstippen zal een perifeer bloedmonster worden verzameld. Elk gepland tijdstip vertegenwoordigt een aspiratie van beenmerg en bloedafname uit de gewone klinische praktijk.

Methoden

Primaire en co-primaire doelstellingen:

Zestig patiënten met nieuw ontstane Acute Myeloïde Leukemie gediagnosticeerd aan de Clinica Ematologica van de Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo van Pavia zullen in drie jaar worden geïncludeerd;

Primair en co-primair doel:

Als standaardprocedure zal de beenmergaspiratie van geïncludeerde patiënten worden verzameld bij diagnose einde inductie, einde consolidatie, follow-up, voor en na HSCT, recidief.

De MSC's zullen worden geïsoleerd uit het beenmerg van AML NPM1mut en AML-NPM1wt personen, en vervolgens "in vitro" gekweekt met 5% geliseerd DMEM+ kweekmedium tot senescentie.

De expressie van de oppervlaktemarkers CD146 en nestin zal worden geëvalueerd door intracellulair labelen en daaropvolgende analyse via MFC FacsCanto II (BD). Het percentage CD146+/nestin+ MSC's bij ziektebegin in patiënten met AML NPM1mut zal worden vergeleken met het percentage van HD en ziektecontroles.

Secundaire doelstellingen:

De karakterisering van BM-MSC's van patiënten door evaluatie van de clonogene efficiëntie (colony forming units, CFU-f). Tegelijkertijd zal de proliferatieve capaciteit worden beoordeeld in termen van cumulatieve populatieverdubbeling (cPD). Senescentie van AML-MSC's zal worden gedefinieerd als het moment waarop het aantal teruggewonnen cellen kleiner of gelijk is aan het aantal gekweekte cellen. Senescente cellen zullen worden gedetecteerd door gebruik van β-galactosidase.

Het vermogen van AML-MSC's om te differentiëren in adipocyten en osteocyten, gestuurd door de toevoeging van specifieke factoren in vitro: de Alizarin rode kleurstof kleurt specifiek lipidedruppels, terwijl de alkalische fosfatase kleurstof de aanwezigheid van calciumafzettingen, typisch voor osteocyten, zal benadrukken.

Op dezelfde tijdstippen zal een perifeer bloedmonster worden verzameld, een restant van de standaard diagnostische analyses uitgevoerd tijdens klinische activiteit. Uit het monster zullen PBMC's worden geëxtraheerd en gebruikt in de daaropvolgende immunomodulatie-experimenten.

Functionele eigenschappen van AML-MSC's zullen worden geëvalueerd na co-cultuur met PBMC's. Na drie dagen incubatie zal het vermogen van MSC's om PBMC-proliferatie te moduleren worden geanalyseerd door incorporatie van Getitreerd Thymidine. De resultaten zullen worden vergeleken met die verkregen van HD-MSC en ziektecontroles.

Na tien dagen incubatie in dezelfde cultuur zal de capaciteit van AML-MSC's om het percentage van de lymfocyt subpopulaties (T- en B-lymfocyten en NK-cellen) te reguleren via MFC worden geëvalueerd, samen met het percentage T-regulerende cellen door meting van intracellulair Foxp3, en de expressie van CXCR4 op het oppervlak van lymfocyten van patiënten. De supernatanten van de cultuur zullen worden opgeslagen en gebruikt om CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 te doseren middels ELISA.

Het DNA geëxtraheerd uit de MSC's van personen met AML NPM1mut en AML NPM1wt zal worden geanalyseerd via een aangepast TruSight Myeloid Sequencing Panel van 54 genen gesequenced door Illumina MiSeq, samen met DNA geëxtraheerd uit leukemische blasten van dezelfde patiënten.

Tertiair exploratief doel Als het percentage CD146+/nestin+ MSC's geschikt is, zal deze subpopulatie worden gesorteerd en zullen de bovengenoemde analyses erop worden uitgevoerd.

De MV's zullen worden geïsoleerd door ultracentrifugatie en gekwantificeerd (NanoSight). De expressie van MV's oppervlaktemarkers zal worden beoordeeld via MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) en MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

Het eiwitgehalte van de MV's zal worden geëvalueerd via HPLC en massaspectrometrie.

Co-cultuur experimenten in aanwezigheid van MV's zullen worden ontwikkeld.

Dataverzameling Gegevens zullen worden vastgelegd in een elektronische database. Patiënten zullen een identificatiecode ontvangen die hun privacy waarborgt. De PI zal afzonderlijk een lijst bijhouden met identificatiegegevens van de patiënt en de corresponderende code.

Berekening steekproefomvang Negentig proefpersonen zullen worden geïncludeerd (60 patiënten: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt en 30 HD-MSC's). Met deze steekproefomvang zal het mogelijk zijn om een significante 2x2 post-hoc vergelijking (tweezijdige type I fout alpha=0.017) in nestin+/CD146+ MSC's niveaus na one-way variantieanalyse te detecteren als het verschil tussen gemiddelden 85% van de gemeenschappelijke standaarddeviatie is. Een power van 80% is overwogen.

Statistische analyse Kwalitatieve variabelen zullen worden beschreven als absolute en relatieve frequenties van elke categorie. Kwantitatieve variabelen zullen worden samengevat als gemiddelde±standaarddeviatie, of door mediaan en interkwartielbereik. Indien nodig zullen log-transformaties van gegevens worden toegepast.

Statistische analyses zullen worden uitgevoerd met Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Statistische analyse voor het primaire eindpunt Nestin+/CD146+ MSC's niveaus bij baseline zullen worden vergeleken tussen drie groepen met one-way variantieanalyse, gevolgd door Bonferroni's 2x2 post-hoc vergelijkingen.

Statistische analyse voor het co-primaire eindpunt De associatie tussen nestin+/CD146+ MSC's niveaus op verschillende tijdstippen en recidief zal worden geëvalueerd door een joint model van longitudinale en overlevingsgegevens.

Statistische analyse voor de secundaire eindpunten

1. De vergelijking volgens NPM1 mutatiestatus zal worden uitgevoerd door het fitten van multilevel mixed (met patiënten behandeld als random effect) lineaire of logistische modellen.
2. De interacties tussen MSC's en leukemische cellen zullen worden geanalyseerd door het fitten van multilevel mixed (met patiënten behandeld als random effect) lineaire of logistische modellen.
3. Fisher's exact test zal worden uitgevoerd om patiënten met AML NPM1mut versus AML-NPM1wt te vergelijken.

Statistische analyse voor tertiaire exploratieve eindpunten Voor tertiaire exploratieve eindpunten zullen beschrijvende statistieken worden gebruikt.

Geïnformeerde toestemming Elke patiënt zal het studie-informatiemateriaal ontvangen en een ondertekend geïnformeerde toestemmingsformulier zal worden verkregen.

Een informatieblad en geïnformeerde toestemming zullen verduidelijken dat de patiënt niet zal worden onderworpen aan extra bloedafnames en beenmergaspiraties.