Mezenchimális őssejtek NPM1 mutált, alacsony kockázatú akut myeloid leukémiában: a tumor mikroörnyezet vizsgálata és annak hozzájárulása a kimenethez

Háttér Az akut myeloid leukémia (AML) egy heterogén hematológiai malignitás, amelyet a myeloid progenitorsejtek klonális expanziója és differenciációs megállása jellemez.

Bár hiányos, az AML patogenezisének jelenlegi ismerete lehetővé tette a betegek különböző prognosztikai csoportokba való besorolását, és személyre szabott kezelési stratégiák kialakulásához vezetett.

A European Leukemia Net (ELN) a de novo AML-t genetikai mutációk és kromoszóma-rendellenességek alapján kedvező, közepes és kedvezőtlen kockázati csoportokba sorolja. Különösen a kedvező kockázati profillal rendelkező betegeket vagy a core-binding faktor átrendeződések (CBF) jelenléte, normál kariotípusú nucleophosmin 1 (NPM1) mutációk és fms kapcsolódó receptor tirozin kináz 3 (FLT3) vad típus, NPM1 mutációk és FLT3-belső tandem duplikáció alacsony allél aránnyal, vagy CCAAT/fokozó kötő fehérje α (CEBPα) biallelikus mutációi jellemzik.

A kedvező kockázati profil ellenére a hagyományos kemoterápia után hosszú távú követésben lévő betegeknél a visszaesési arány akár 50% is lehet NPM1 mutációval rendelkező AML-ben, 40% CBF AML-ben és 44% CEBPα biallelikus mutációval rendelkező AML-ben. Ezek az adatok rávilágítanak a további vizsgálatok szükségességére a kedvező kockázatú AML-ben, hogy több ismeretet szerezzenek a patogenetikus és rezisztencia mechanizmusokról, ezáltal javítva a betegbesorolást. Ráadásul ezek a betekintések új terápiás célpontok felfedezéséhez vezethetnek.

Az NPM1 a leggyakoribb mutáció az AML-ben, amely a de novo citogenetikailag normál AML körülbelül 50-60%-át teszi ki. Egér- és in vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az NPM1 mutáció elősegíti a leukemogenezist és a myeloproliferációt, de nem elegendő a leukémia kialakításához. A hematopoietikus őssejtek (HSC) előzetes mutációi lehetnek egy lehetséges mechanizmus, amely együttműködik a leukemogenezisben. Ezek a mutációk főleg epigenetikai módosítókat érintenek a hematopoietikus ős- vagy progenitorsejtekben, ami klonális expanziójukhoz vezet egyértelmű hematológiai betegség nélküli egyénekben. Ezt az állapotot, amelyet klonális hematopoiezisnek neveznek, pre-leukémiás állapotnak tekintik, amely elősegítheti a leukemogenezist hajtó mutációk megjelenését. Valóban, az NPM1 mutációk gyakran együtt fordulnak elő a jelátviteli utak, DNS-metiláció, RNS-splajszing, kohezin komplex, géntranszkripció és tumorszuppresszió géneit érintő társmutációkkal.

Bár néhány tanulmány kimutatta, hogy néhány társmutáció negatívan befolyásolja a betegség prognózisát, viták maradnak a valódi hatásukról. Ezért a mutációs táj egyedül nem magyarázhatja teljesen néhány beteg klinikai lefolyását ebben az alacsony kockázatú leukémiacsoportban; más tényezők is szerepet játszhatnak ennek az AML alcsoportnak a heterogenitásában. Nemrégiben nagy erőfeszítéseket tettek a leukémiás hematopoietikus niche megértésére, amely a betegség refrakteritásában és visszaesésében játszik szerepet.

A hematopoietikus őssejtek a csontvelői mikrokörnyezettel való kölcsönhatáson keresztül szabályozzák proliferációjukat, differenciációjukat és önújítási folyamataikat egy specifikus csontvelői niche-ben. A mikrokörnyezetnek van egy celluláris kompartimentje, amely főleg mezenchimális őssejtekből (MSC), de osteoblasztokból, endotélsejtekből, makrofágokból áll. Különösen az MSC alcsoportoknak különböző szerepük van a HSC aktivitásának szabályozásában.

A leukémia őssejtek egy kis alcsoportja a leukémiás sejteknek, amelyek képesek önújításra és őssejt tulajdonságokkal rendelkeznek. Definíció szerint ezek a sejtek újra elindíthatják a leukémiát, ha befogadó gazdaszervezetbe ültetik őket.

A csontvelői mikrokörnyezet kölcsönhatásba lép a leukémiás őssejtekkel (LSC) is, megváltoztatva proliferációjukat, adhéziós tulajdonságaikat, nyugalmi állapotukat és klonális expanziójukat.

Ugyanakkor tanulmányok kimutatták, hogy az LSC-k újraprogramozhatják az MSC-ket és trófikus támogatást kaphatnak, védelmet az oxidatív stresszel szemben és megőrzést a toxikus kemoterápiás szerek elől, elősegítve egy "leukémiás niche" kialakulását. Másrészt a csontvelői MSC-k közvetlenül vagy közvetve kölcsönhatásba lépnek az LSC-kkel, és megváltoztatják az LSC-k proliferációját, adhéziós tulajdonságait, nyugalmi állapotát és klonális expanzióját. Ennek eredményeként az MSC-k hozzájárulnak az LSC fenntartásához. Az MSC átalakulás egy leukemogenezis önújító stratégiája, amely megmagyarázhatja a klinikai heterogenitást, és így potenciális prognosztikai tényező lehet.

Több tanulmány kimutatta funkcionális elváltozások jelenlétét a csontvelői MSC szintjén AML-betegekben, például csökkent proliferáció, növekedett apoptotikus arány és pro-inflammatorikus állapot.

Bár úgy tűnik, hogy a csontvelői mikrokörnyezet kulcsszerepet játszik a kemorezisztencia elősegítésében az AML-ben, még mindig tisztázatlan, hogy ezek az elváltozások vagy mások kapcsolódnak-e a leukémia patogeneziséhez.

Az AML-betegek módosult MSC jellemzőkkel rendelkeznek; különösen csökkent mennyiségű primitív MSC van, amelyet CD146+/nestin+-ként definiálnak, az egészséges donorokhoz (HD) képest. A Nestin+ csontvelői MSC-k az oxidatív foszforiláció stimulálásával és így az energiatermelés növelésével fokozzák a leukémiás sejtek túlélését és kemorezisztenciáját. Ez az alpopuláció úgy tűnik, hogy összefügg a betegség lefolyásával: a visszaeső betegeknél megnövekedett százalékban vannak CD146+/nestin+ MSC-k a remisszióban lévő alanyokhoz képest.

Továbbá a módosított MSC-k eltérően lépnek kölcsönhatásba HSC-vel és LSC-vel, szelektíven gátolva a normál hematopoiezist és elősegítve a leukemogenezist és kemorezisztenciát. A stroma által közvetített leukémiás sejtek védelmének mechanizmusa komplex és citokinek, kemokinek, oldható faktorok és mikrovezikulumok (MV) hálózatát foglalja magában, amelyek elősegítik az LSC-k proliferációját. Egy valószínű hatásmechanizmus a csontvelői stromasejtek és LSC-k kölcsönhatása az MSC-k által kibocsátott CXCL12 és annak a CXCR4 receptorhoz való kötődése az LSC-k felületén. Részletesebben, a leukémiás sejtek kihasználják a CXCL12/CXCR4 tengelyt egy védő csontvelői niche-be való honingoláshoz, amely általában a normál HSC-re korlátozódik. Ennek eredményeként az LSC-k egy olyan környezetben tartózkodnak, amely elősegíti túlélésüket és védi őket a kemoterápiától. Emiatt a CXCL12/CXCR4 tengely célpontja lehet a jövőbeli terápiáknak a visszaesések megelőzése érdekében.

Tudomásunk szerint nincs adat a csontvelői mikrokörnyezet jellemzéséről NPM1 mutált AML-ben. Az MSC-k jellemzése, mint a csontvelői mikrokörnyezet legreprezentatívabb összetevői, hasznos lehet specifikus celluláris mechanizmusok azonosításához, amelyek megmagyarázhatják az ezekben a betegekben megfigyelt magas visszaesési arányt.

A tanulmány céljai

Általános cél:

A csontvelői MSC-k jellemzése az NPM1mut AML-ben érintett alanyokban, mint lehetséges új indikátorok a beteg klinikai kimenetelére.

Részletesen, az AML-MSC-k fenotípusát, genetikai profilját és funkcióját tanulmányozzák, és értékelik parakrin aktivitásukat annak érdekében, hogy megértsék azokat a mechanizmusokat, amelyek elősegítik a terápiával szembeni rezisztenciát és a visszaesés előfordulását az NPM1mut AML-ben a csontvelői mikrokörnyezet szintjén. Az MSC-k parakrin aktivitását az MSC-k által depriváció után kibocsátott mikrovezikulumok tanulmányozásán és jellemzésén keresztül értékelik.

Elsődleges cél:

Ennek a tanulmánynak az elsődleges célja a CD146+ MSC-k százalékának kimutatása diagnózisnál, mivel ez az alpopuláció úgy tűnik, hogy részt vesz az LSC niche kialakításában és kemorezisztenciában. Leírták, hogy a visszaeső betegek csontvelője magasabb százalékot mutat ebből az MSC alpopulációból a klinikai remisszióban lévő betegekhez képest. A cél annak demonstrálása, hogy az NPM1mut AML-betegekben statisztikailag szignifikáns különbség van a CD146+ MSC százalékban (diagnózisnál) az HD-MSC-khez és DC-MSC-khez (betegségkontroll MSC: NPM1 wt AML-betegek) képest.

Közös elsődleges cél:

A CD146+ sejtek százalékának összehasonlítása diagnózisnál és különböző időpontokban (diagnózis, indukció után, kezelés vége, követés, transzplantáció előtt, visszaesés) a visszaeső betegek és a nem visszaeső betegek között a teljes populációban (AML NPM1mut és AML-NPM1wt)

Másodlagos célok:

1. Az MSC CD146+ alpopuláció összehasonlítása NPM1mut és NPM1wt AML-betegekben minden előre meghatározott időpontban.

2. Az AML-MSC-k jellemzése NPM1mut vs NPM1wt AML-betegekben. Az MSC-k definíciójára vonatkozó nemzetközi irányelvek (Dominici et al., 2006) alapján értékelik a morfológiát, a műanyaghoz való adhézió képességét, a klonogén hatékonyságot, a proliferációs kapacitást és az öregedésbe való átmenetet. A felületi markerek CD105, CD73 és CD90 expresszióját és a CD45, CD34, CD14, CD19 és HLA-DR hiányát értékelik monoklonális antitestekkel való jelöléssel és multiparaméteres áramlási citometria (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson) segítségével. A CD146 és nestin expresszióját a specifikus időpontokban kapott mintákon értékelik. Az AML-MSC-k adipocitákká és osteocitákká differenciálódási képességét "in vitro" stimuláció után határozzák meg a megfelelő differenciációs faktorokkal.

3. Az MSC-k funkcionális jellemzése NPM1mut vs NPM1wt AML-betegektől. Az MSC-k funkcionális tulajdonságait egy autológ (beteg perifériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC)/beteg MSC) és allogén (egészséges donor PBMC/beteg MSC) AML-MSC kokultúra kifejlesztésén keresztül értékelik. Ezután értékelik az immunmoduláló potenciált, a T, B és NK alpopulációk generálásának képességét és a CXCR4/CXCL12 tengely szabályozását. Továbbá, a pro-inflammatorikus és regulátor citokinek mennyiségét a kultúra szupernatánsában kvantifikálják.
4. Az MSC-k genomikai jellemzése NPM1mut vs NPM1wt AML-betegekben. Next generation sequencing (NGS) segítségével, egy myeloid neopláziákban gyakran mutálódó gének paneljével.

Harmadlagos exploratív cél

• A CD146+/nestin+ MSC alpopuláció szortírozása jövőbeli in vitro kokultúra tanulmányokhoz
• A depriváció után az AML-MSC-k által kibocsátott MV-k izolálása és jellemzése.
• HD PBMC kultúrák kifejlesztése MV-kkel annak érdekében, hogy értékeljék parakrin aktivitásukat.

Tanulmány tervezés Ez egy pilot egyközpontú prospektív megfigyelési, longitudinális, in vitro tanulmány

Alanyok és bevonási kritériumok Felnőtt betegek új kezdetű Akut Myeloid Leukémiával, diagnosztizálva a Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia Clinica Ematologicáján.

A kontrollok egészséges hematopoietikus őssejt donorok csontvelői transzplantációra, akiket a Oncoematologia Pediatrica regisztrál, a tájékoztatott beleegyező nyilatkozat aláírása után.

Minták gyűjtése A csontvelői MSC-k expanziója és elemzése kiválasztott időpontokban (diagnózis, indukció vége, konszolidáció vége, követés, hematopoietikus őssejt transzplantáció (HSCT) előtt, visszaesés).

Ugyanazon időpontokban perifériás vér minta gyűjtésre kerül. Minden tervezett időpont egy szokásos klinikai gyakorlatú csontvelői aspirációt és vérgyűjtést jelent.

Módszerek

Elsődleges és közös elsődleges célok:

Hatvan beteget új kezdetű Akut Myeloid Leukémiával, diagnosztizálva a Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia Clinica Ematologicáján, három év alatt regisztrálnak;

Elsődleges és közös elsődleges cél:

Standard eljárásként a regisztrált betegek csontvelői aspirátumát diagnózisnál, indukció végén, konszolidáció végén, követésben, HSCT előtt és után, visszaeséskor gyűjtik.

Az MSC-ket izolálják az NPM1mut és NPM1wt AML alanyok csontvelőjéből, majd "in vitro" kultiválják 5% lizált DMEM+ kultúraközeggel öregedésig.

A felületi markerek CD146 és nestin expresszióját intracitoplazmatikus jelöléssel és későbbi MFC FacsCanto II (BD) elemzéssel értékelik. A CD146+/nestin+ MSC-k százalékát a betegség kezdetén NPM1mut AML-betegekben összehasonlítják az HD és betegségkontrollok százalékával.

Másodlagos célok:

A betegek csontvelői MSC-k jellemzése a klonogén hatékonyság (kolónia képző egységek, CFU-f) értékelésével. Eközben a proliferációs kapacitást kumulatív populáció duplázódás (cPD) szempontjából értékelik. Az AML-MSC-k öregedését az időpontként definiálják, amikor a visszanyert sejtek száma kevesebb vagy egyenlő, mint a kultivált sejtek száma. Öregedő sejteket β-galaktosidázzal detektálnak.

Az AML-MSC-k adipocitákká és osteocitákká differenciálódási képessége, specifikus faktorok in vitro hozzáadásával vezérelve: az Alizarin vörös festék specifikusan színezi a lipid cseppeket, míg az alkáli foszfatáz festék kiemeli a kalcium lerakódások jelenlétét, amelyek jellemzőek az osteocitákra.

Ugyanazon időpontokban perifériás vér mintát gyűjtenek, a standard diagnosztikai elemzések maradékát a klinikai tevékenység során. A mintából PBMC-t extrahálnak és használják a későbbi immunmodulációs kísérletekben.

Az AML-MSC-k funkcionális tulajdonságait PBMC-vel való kokultúra után értékelik. Három napos inkubáció után az MSC-k PBMC proliferációt módosító képességét Titrált Timidin beépülésével elemzik. Az eredményeket összehasonlítják a HD-MSC és betegségkontrolloktól kapottakkal.

Tíz napos inkubáció után ugyanabban a kultúrában értékelik az AML-MSC-k linfocita alpopulációk (T és B limfociták és NK sejtek) százalékát szabályozó képességét MFC segítségével, a T regulátor sejtek százalékával együtt az intracitoplazmatikus Foxp3 mérésén keresztül, és a CXCR4 expresszióját a betegek limfocitáinak felületén. A kultúra szupernatánsait tárolják és használják CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 mennyiségének meghatározására ELISA segítségével.

A NPM1mut és NPM1wt AML alanyok MSC-jeiből extrahált DNS-t egy egyedi TruSight Myeloid Sequencing Panel segítségével elemzik 54 gén Illumina MiSeq szekvenálásával, együtt ugyanazon betegek leukémiás blasztjaiból extrahált DNS-sel.

Harmadlagos exploratív cél Ha a CD146+/nestin+ MSC-k százaléka megfelelő lesz, ezt az alpopulációt szortírozzák és a fent említett elemzéseket elvégzik rajta.

A MV-ket ultracentrifugálással izolálják és kvantifikálják (NanoSight). A MV-k felületi markereinek expresszióját MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) és MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi) segítségével értékelik.

A MV-k fehérje tartalmát HPLC és tömegspektrometriával értékelik.

MV-k jelenlétében kokultúra kísérleteket fejlesztenek.

Adatgyűjtés Az adatokat egy elektronikus adatbázisban rögzítik. A betegek egy azonosító kódot kapnak, amely biztosítja adatvédelmüket. A PI külön tartja a betegek azonosító adatait és a megfelelő kódot tartalmazó listát.

Mintanagyság számítás Kilencven alanyt regisztrálnak (60 beteg: 30 NPM1mut AML, 30 NPM1wt AML és 30 HD-MSC). Ezzel a mintanagysággal lehetőség van szignifikáns 2x2 post-hoc összehasonlítás (kétoldali I. típusú hiba alfa=0,017) kimutatására nestin+/CD146+ MSC szintekben egyszempontos varianciaanalízis után, ha a közös szórás 85%-a a különbség az átlagok között. 80% erejű tesztet vettek figyelembe.

Statisztikai elemzés A kvalitatív változókat abszolút és relatív gyakoriságként írják le minden kategóriában. A kvantitatív változókat átlag±szórás, vagy medián és interkvartilis tartományként összegzik. Ha szükséges, adatok log-transzformációját alkalmazzák.

Statisztikai elemzéseket Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.) segítségével végeznek.

Statisztikai elemzés az elsődleges végpontra A nestin+/CD146+ MSC szintek alapvonalon három csoport között egyszempontos varianciaanalízissel hasonlítják össze, majd Bonferroni 2x2 post-hoc összehasonlításokkal.

Statisztikai elemzés a közös elsődleges végpontra A nestin+/CD146+ MSC szintek különböző időpontokban és a visszaesés közötti asszociációt longitudinális és túlélési adatok közös modelljével értékelik.

Statisztikai elemzés a másodlagos végpontokra

1. Az összehasonlítás NPM1 mutációs státusz szerint multilevel mixed (a betegek random hatásként kezelve) lineáris vagy logisztikus modellek illesztésével történik.
2. Az MSC-k és leukémiás sejtek közötti kölcsönhatásokat multilevel mixed (a betegek random hatásként kezelve) lineáris vagy logisztikus modellek illesztésével elemzik.
3. Fisher exact tesztet végeznek annak érdekében, hogy összehasonlítsák a NPM1mut vs NPM1wt AML-betegeket.

Statisztikai elemzés a harmadlagos exploratív végpontokra A harmadlagos exploratív végpontokra leíró statisztikákat alkalmaznak.

Tájékoztatott beleegyező nyilatkozat Minden beteg megkapja a tanulmány tájékoztató anyagát és aláírt tájékoztatott beleegyező nyilatkozatot szereznek.

Egy tájékoztató füzet és tájékoztatott beleegyező nyilatkozat tisztázza, hogy a beteget nem vetik alá további vérvételnek és csontvelői aspirációnak.