Células Estaminais Mesenquimais na Leucemia Mieloide Aguda de Baixo Risco com Mutação NPM1: Um Estudo do Microambiente Tumoral e da sua Contribuição para o Resultado

Contexto A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica heterogénea caracterizada pela expansão clonal e paragem de diferenciação das células progenitoras mieloides.

Apesar de incompleto, o conhecimento atual da patogénese da LMA permitiu a estratificação dos pacientes em diferentes grupos prognósticos e levou ao surgimento de estratégias de tratamento personalizadas.

A European Leukemia Net (ELN) estratifica a LMA de novo em grupos de risco favorável, intermédio e adverso de acordo com mutações genéticas e anomalias cromossómicas. Em particular, os pacientes com um perfil de risco favorável caracterizam-se pela presença de rearranjos do fator de ligação ao núcleo (CBF), cariótipo normal com mutações da nucleofosmina 1 (NPM1) e do recetor tirosina quinase relacionado com fms tipo 3 (FLT3) do tipo selvagem, mutações NPM1 e duplicação em tandem interna do FLT3 com baixa razão alélica, ou mutações bialélicas no fator de ligação CCAAT/realçador de proteína α (CEBPα).

Apesar do perfil de risco favorável, os pacientes em seguimento a longo prazo após quimioterapia convencional apresentam taxas de recidiva de até 50% na LMA com mutação NPM1, 40% na LMA CBF e 44% na LMA com mutação bialélica CEBPα. Estes dados destacam a necessidade de investigação adicional na LMA de risco favorável para obter mais conhecimento sobre os mecanismos patogénicos e de resistência, melhorando assim a estratificação dos pacientes. Além disso, estas perspetivas poderão levar à descoberta de novos alvos terapêuticos.

A NPM1 é a mutação mais frequente na LMA, representando aproximadamente 50-60% da LMA de novo citogeneticamente normal. Estudos em murganhos e in vivo demonstraram que a mutação NPM1 promove a leucogénese e mieloproliferação, mas não é suficiente para induzir leucemia. Mutações pré-existentes das células estaminais hematopoiéticas (CEH) podem ser um mecanismo possível que coopera na leucogénese. Estas mutações envolvem principalmente modificadores epigenéticos em células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, resultando na sua expansão clonal em indivíduos sem doença hematológica evidente. Esta condição, denominada hematopoiese clonal, representa um estado pré-leucémico que pode promover o surgimento de mutações capazes de induzir leucogénese. De facto, as mutações NPM1 frequentemente agrupam-se com mutações co-ocorrentes envolvendo genes das vias de sinalização, metilação do ADN, splicing do ARN, complexo da coesina, transcrição genética e supressão tumoral.

Apesar de alguns estudos terem mostrado que certas mutações co-ocorrentes afetam negativamente o prognóstico da doença, permanecem controvérsias sobre o seu impacto real. Portanto, o panorama mutacional por si só não pode explicar totalmente os cursos clínicos de alguns pacientes neste grupo de leucemias de baixo risco; outros fatores podem desempenhar um papel na heterogeneidade deste subgrupo de LMA. Recentemente, foram feitos grandes esforços para obter perspetivas sobre o nicho hematopoiético leucémico, que está implicado na refractariedade e recidiva da doença.

As Células Estaminais Hematopoiéticas regulam os seus processos de proliferação, diferenciação e autorrenovação num nicho específico da medula óssea, através da interação com o microambiente da MO. O microambiente tem um compartimento celular que consiste principalmente em células estaminais mesenquimatosas (CEM), mas também em osteoblastos, células endoteliais, macrófagos. Em particular, os subgrupos de CEM têm diferentes papéis na regulação da atividade das CEH.

As células estaminais leucémicas são um pequeno subgrupo de células leucémicas capazes de autorrenovação e com propriedades de estaminalidade. Por definição, estas células podem reiniciar a leucemia se enxertadas num hospedeiro recetor.

O microambiente da MO também interage com as células estaminais leucémicas (CEL), alterando a sua proliferação, propriedades de adesão, quiescência e expansão clonal.

Simultaneamente, estudos mostraram que as CEL podem reprogramar as CEM e receber suporte trófico, proteção contra stresse oxidativo e preservação de agentes quimioterapêuticos tóxicos, promovendo a formação de um "nicho leucémico". Por outro lado, as CEM da MO interagem com as CEL, direta ou indiretamente, e alteram a proliferação, propriedades de adesão, quiescência e expansão clonal das CEL. Como resultado, as CEM contribuem para a manutenção das CEL. A remodelação das CEM é uma estratégia de autorrenovação da leucogénese que poderia explicar a heterogeneidade clínica e, assim, poderia ser um potencial fator prognóstico.

Vários estudos revelaram a presença de alterações funcionais ao nível das CEM-MO em pacientes com LMA, como diminuição da proliferação, aumento da taxa apoptótica e um estado pró-inflamatório.

Apesar de o microambiente da MO parecer desempenhar um papel fundamental na promoção da quimiorresistência na LMA, ainda não é claro se estas alterações ou outras estão relacionadas com a patogénese da leucemia.

Os pacientes com LMA apresentam características das CEM alteradas; em particular, há uma quantidade reduzida de CEM primitivas, definidas como CD146+/nestina+, em comparação com dadores saudáveis (DS). As CEM-MO nestina+ melhoram a sobrevivência das células leucémicas e a quimiorresistência através da estimulação da fosforilação oxidativa e, assim, aumentando a produção de energia. Esta subpopulação parece estar associada ao curso da doença: os pacientes que recidivam apresentam uma percentagem aumentada de CEM CD146+/nestina+ em relação aos sujeitos em remissão.

Além disso, as CEM modificadas interagem de forma diferente com as CEH e CEL, inibindo seletivamente a hematopoiese normal e promovendo a leucogénese e quimiorresistência, respetivamente. O mecanismo de proteção mediada pelo estroma das células leucémicas é complexo e envolve uma rede de citocinas, quimiocinas, fatores solúveis e microvesículas (MVs) que promovem a proliferação das CEL. Um provável mecanismo de ação é a interação entre as células estromais da MO e as CEL através da libertação de CXCL12 pelas CEM e sua ligação ao recetor CXCR4 na superfície das CEL. Mais detalhadamente, as células leucémicas exploram o eixo CXCL12/CXCR4 para homing num nicho protetor da MO, que normalmente é restrito às CEH normais. Como resultado, as CEL residem num ambiente que promove a sua sobrevivência e as protege da quimioterapia. Por esta razão, o eixo CXCL12/CXCR4 poderá ser alvo de futuras terapias para prevenir recidivas.

Até onde sabemos, não existem dados relativos à caracterização do microambiente da MO, na LMA com mutação NPM1. A caracterização das CEM, como os componentes mais representativos do microambiente da MO, poderá ser útil para a identificação de mecanismos celulares específicos que possam explicar a elevada taxa de recidiva observada nestes pacientes.

Objetivos do estudo

Objetivo geral:

Caracterizar as CEM-MO de sujeitos afetados por LMA NPM1mut como possíveis novos indicadores do resultado clínico do paciente.

Em detalhe, será estudado o fenótipo, perfil genético e função das CEM-LMA, e avaliada a sua atividade parácrina para compreender os mecanismos que promovem a resistência à terapia e a ocorrência de recidiva na LMA NPM1mut ao nível do microambiente da medula óssea. A atividade parácrina das CEM será avaliada através do estudo e caracterização das microvesículas libertadas pelas CEM após privação.

Objetivo Primário:

O objetivo primário deste estudo é a deteção da percentagem de CEM CD146+ no diagnóstico, uma vez que esta subpopulação parece estar envolvida na criação do nicho das CEL e na quimiorresistência. Foi descrito que a MO de pacientes recidivados apresenta maior percentagem desta subpopulação de CEM em comparação com pacientes em remissão clínica. O objetivo é demonstrar que em pacientes com LMA NPM1mut existe uma diferença estatisticamente significativa na percentagem de CEM CD146+ (no diagnóstico) em comparação com CEM-DS e CEM-DC (CEM controlo de doença: pacientes com LMA NPM1 wt).

Objetivo coprimário:

Comparação da percentagem de células CD146+ no diagnóstico e em diferentes momentos (diagnóstico, pós-indução, fim do tratamento, seguimento, pré-transplante, recidiva) entre pacientes recidivados e pacientes que não recidivam em toda a população (LMA NPM1mut e LMA-NPM1wt)

Objetivos secundários:

1. Comparar a subpopulação de CEM CD146+ em pacientes com LMA NPM1mut e LMA NPM1wt em cada momento pré-definido.

2. Caracterizar as CEM-LMA em pacientes com LMA NPM1mut vs LMA NPM1wt. Seguindo as diretrizes internacionais para a definição de CEM (Dominici et al., 2006), serão avaliadas a morfologia, a capacidade de aderir ao plástico, a eficiência clonogénica, a capacidade proliferativa e a transição para senescência.

   A expressão dos marcadores de superfície CD105, CD73 e CD90 e a ausência de CD45, CD34, CD14, CD19 e HLA-DR serão avaliadas através de marcação com anticorpos monoclonais e avaliação por citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). A expressão de CD146 e nestina será avaliada nas amostras obtidas em momentos específicos. A capacidade das CEM-LMA de diferenciar em adipócitos e osteócitos será determinada após estimulação "in vitro" com os fatores de diferenciação apropriados.

3. Caracterização funcional das CEM de pacientes com LMA NPM1mut vs LMA NPM1wt. As propriedades funcionais das CEM serão avaliadas através do desenvolvimento de um co-cultivo de CEM-LMA no contexto autólogo (células mononucleares do sangue periférico do paciente (CMSP)/CEM do paciente) e alogénico (CMSP de dador saudável/CEM do paciente). Em seguida, será avaliado o potencial imunomodulador, a capacidade de gerar subpopulações T, B e NK e a regulação do eixo CXCR4/CXCL12. Além disso, serão quantificadas as citocinas pró-inflamatórias e reguladoras no sobrenadante da cultura.
4. Caracterização genómica das CEM em pacientes com LMA NPM1mut vs LMA-NPM1wt Utilizando sequenciação de próxima geração (NGS) com o auxílio de um painel de genes mutados recorrentemente em neoplasias mieloides.

Objetivo exploratório terciário

• Separação da subpopulação de CEM CD146+/nestina+ para futuros estudos de co-cultivo in vitro
• Isolamento e caracterização das MVs libertadas pelas CEM-LMA após privação.
• Desenvolvimento de culturas de CMSP de DS com MVs para avaliar a sua atividade parácrina.

Desenho do estudo Este é um estudo piloto prospetivo observacional longitudinal in vitro de centro único

Sujeitos e critérios de inclusão Pacientes adultos com início novo de Leucemia Mieloide Aguda diagnosticados na Clínica Hematológica da Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Os controlos são dadores saudáveis de células estaminais hematopoiéticas para transplante de medula óssea recrutados pela Oncohematologia Pediátrica, após assinatura do consentimento informado

Recolha de Amostras Expansão e análise das CEM da medula óssea em momentos selecionados (diagnóstico, fim da indução, fim da consolidação, seguimento, antes do transplante de células estaminais hematopoiéticas (TCEH), recidiva).

Nos mesmos momentos, será recolhida uma amostra de sangue periférico. Cada momento planeado representa uma aspiração de medula óssea e recolha de sangue da prática clínica habitual.

Métodos

Objetivos primário e coprimário:

Sessenta pacientes com início novo de Leucemia Mieloide Aguda diagnosticados na Clínica Hematológica da Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia serão recrutados em três anos;

Objetivo primário e coprimário:

Como procedimento padrão, a aspiração de medula óssea dos pacientes recrutados será recolhida no diagnóstico, fim da indução, fim da consolidação, seguimento, antes e após TCEH, recidiva.

As CEM serão isoladas da medula óssea de sujeitos com LMA NPM1mut e LMA-NPM1wt, e depois cultivadas "in vitro" com meio de cultura DMEM+ 5% lisado até senescência.

A expressão dos marcadores de superfície CD146 e nestina será avaliada através de marcação intracitoplasmática e análise subsequente por MFC FacsCanto II (BD). A percentagem de CEM CD146+/nestina+ no início da doença em pacientes com LMA NPM1mut será comparada com a percentagem de DS e controlos de doença.

Objetivos secundários:

A caracterização das CEM-MO dos pacientes através da avaliação da eficiência clonogénica (unidades formadoras de colónias, CFU-f). Entretanto, a capacidade proliferativa será avaliada em termos de duplicação populacional cumulativa (cPD). A senescência das CEM-LMA será definida como o momento em que o número de células recuperadas é menor ou igual ao número de células cultivadas. As células senescentes serão detetadas utilizando β-galactosidase.

A capacidade das CEM-LMA de diferenciar em adipócitos e osteócitos, induzida pela adição de fatores específicos in vitro: o corante Alizarina red colore especificamente gotículas lipídicas, enquanto o corante da fosfatase alcalina destacará a presença de depósitos de cálcio, típicos dos osteócitos.

Nos mesmos momentos, será recolhida uma amostra de sangue periférico, um resíduo das análises diagnósticas padrão realizadas durante a atividade clínica. Da amostra, serão extraídas CMSP e utilizadas nos subsequentes experimentos de imunomodulação.

As propriedades funcionais das CEM-LMA serão avaliadas após co-cultivo com CMSP. Após três dias de incubação, a capacidade das CEM de modular a proliferação das CMSP será analisada através da incorporação de Timidina Tritiada. Os resultados serão comparados com os obtidos a partir de CEM-DS e controlos de doença.

Após dez dias de incubação na mesma cultura, será avaliada a capacidade das CEM-LMA de regular a percentagem das subpopulações linfocitárias (linfócitos T e B e células NK) através de MFC, juntamente com a percentagem de células T reguladoras através da medição de Foxp3 intracitoplasmático, e a expressão de CXCR4 na superfície dos linfócitos dos pacientes. Os sobrenadantes da cultura serão armazenados e utilizados para dosear CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 por meio de ELISA.

O ADN extraído das CEM de sujeitos com LMA NPM1mut e LMA NPM1wt será analisado através de um painel personalizado TruSight Myeloid Sequencing Panel de 54 genes sequenciados por Illumina MiSeq, juntamente com ADN extraído de blastos leucémicos dos mesmos pacientes.

Objetivo exploratório terciário Se a percentagem de CEM CD146+/nestina+ for adequada, esta subpopulação será separada e as análises acima mencionadas serão realizadas nela.

As MVs serão isoladas através de ultracentrifugação e quantificadas (NanoSight). A expressão dos marcadores de superfície das MVs será avaliada através do Kit MACSPlex Exosomes (Miltenyi) e do Citómetro de Fluxo MacsQuant (Miltenyi).

O conteúdo proteico das MVs será avaliado através de HPLC e espectrometria de massa.

Serão desenvolvidos experimentos de co-cultivo na presença de MVs.

Recolha de Dados Os dados serão registados numa base de dados eletrónica. Os pacientes receberão um código de identificação que garante a sua privacidade. O IP manterá separadamente uma lista com os dados de identificação do paciente e o código correspondente.

Cálculo do tamanho da amostra Noventa sujeitos serão recrutados (60 pacientes: 30 LMA NPM1mut, 30 LMA NPM1wt e 30 CEM-DS). Com este tamanho amostral será possível detetar uma comparação post-hoc 2x2 significativa (erro tipo I bilateral alfa=0,017) nos níveis de CEM nestina+/CD146+ após análise de variância unidirecional se a diferença entre médias for 85% do desvio padrão comum. Foi considerada uma potência de 80%.

Análise estatística As variáveis qualitativas serão descritas como frequências absolutas e relativas de cada categoria. As variáveis quantitativas serão resumidas como média±desvio padrão, ou por mediana e intervalo interquartil. Se necessário, serão adotadas transformações logarítmicas dos dados.

As análises estatísticas serão realizadas utilizando o Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Análise estatística para o endpoint primário Os níveis de CEM nestina+/CD146+ na linha de base serão comparados entre três grupos com análise de variância unidirecional, seguida de comparações post-hoc 2x2 de Bonferroni.

Análise estatística para o endpoint coprimário A associação entre os níveis de CEM nestina+/CD146+ em diferentes momentos e a recidiva será avaliada por um modelo conjunto de dados longitudinais e de sobrevivência.

Análise estatística para os endpoints secundários

1. A comparação de acordo com o estado mutacional NPM1 será realizada ajustando modelos lineares ou logísticos mistos multinível (com pacientes tratados como efeito aleatório).
2. As interações entre CEM e células leucémicas serão analisadas ajustando modelos lineares ou logísticos mistos multinível (com pacientes tratados como efeito aleatório).
3. O teste exato de Fisher será realizado para comparar pacientes com LMA NPM1mut vs LMA-NPM1wt.

Análise estatística para endpoints exploratórios terciários Para endpoints exploratórios terciários, serão empregues estatísticas descritivas.

Consentimento informado Cada paciente receberá o material informativo do estudo e será obtido o formulário de consentimento informado assinado.

Um folheto informativo e o consentimento informado esclarecerão que o paciente não será submetido a colheitas de sangue e aspirações de medula óssea adicionais.