Мезенхимальные стволовые клетки при низкорисковом остром миелоидном лейкозе с мутацией NPM1: исследование микроокружения опухоли и его вклада в исход заболевания

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — это гетерогенное гематологическое злокачественное заболевание, характеризующееся клоновой экспансией и блокадой дифференцировки миелоидных клеток-предшественников.

Хотя современные знания о патогенезе ОМЛ неполны, они позволили стратифицировать пациентов на различные прогностические группы и привели к появлению персонализированных стратегий лечения.

Европейская сеть по лейкозам (European Leukemia Net, ELN) стратифицирует впервые выявленный ОМЛ на группы благоприятного, промежуточного и неблагоприятного риска в соответствии с генетическими мутациями и хромосомными аномалиями. В частности, пациенты с профилем благоприятного риска характеризуются либо наличием перестроек core-binding factor (CBF), нормальным кариотипом с мутациями нуклеофосмина 1 (NPM1) и диким типом рецепторной тирозинкиназы 3, родственной fms (FLT3), мутациями NPM1 и внутренней тандемной дупликацией FLT3 с низким аллельным соотношением, либо биаллельными мутациями в CCAAT/энхансер-связывающем белке α (CEBPα).

Несмотря на профиль благоприятного риска, у пациентов при длительном наблюдении после стандартной химиотерапии частота рецидивов достигает 50% при ОМЛ с мутацией NPM1, 40% при CBF-ОМЛ и 44% при ОМЛ с биаллельной мутацией CEBPα. Эти данные подчеркивают необходимость дальнейших исследований среди ОМЛ благоприятного риска для получения дополнительных знаний о патогенетических механизмах и механизмах резистентности, что позволит улучшить стратификацию пациентов. Более того, эти знания могут привести к открытию новых терапевтических мишеней.

Мутация NPM1 является наиболее частой мутацией при ОМЛ, составляя примерно 50-60% впервые выявленного цитогенетически нормального ОМЛ. Исследования на мышах и in vivo продемонстрировали, что мутация NPM1 способствует лейкемогенезу и миелопролиферации, но недостаточна для индукции лейкоза. Предсуществующие мутации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) могут быть возможным механизмом, способствующим лейкемогенезу. Эти мутации в основном затрагивают эпигенетические модификаторы в гемопоэтических стволовых или клетках-предшественниках, что приводит к их клоновой экспансии у лиц без явного гематологического заболевания. Это состояние, называемое клоновым гемопоэзом, представляет собой предлейкемическое состояние, которое может способствовать появлению мутаций, способных запустить лейкемогенез. Действительно, мутации NPM1 часто сочетаются с сопутствующими мутациями, затрагивающими гены сигнальных путей, метилирования ДНК, сплайсинга РНК, комплекса когезина, транскрипции генов и супрессии опухолей.

Хотя некоторые исследования показали, что некоторые сопутствующие мутации негативно влияют на прогноз заболевания, остаются разногласия относительно их реального влияния. Следовательно, только мутационный ландшафт не может полностью объяснить клиническое течение некоторых пациентов в этой группе лейкозов низкого риска; другие факторы могут играть роль в гетерогенности этой подгруппы ОМЛ. В последнее время были предприняты значительные усилия для изучения лейкемической гемопоэтической ниши, которая участвует в рефрактерности заболевания и рецидивах.

Гемопоэтические стволовые клетки регулируют свои процессы пролиферации, дифференцировки и самообновления в специфической костномозговой нише посредством взаимодействия с микроокружением костного мозга. Микроокружение имеет клеточный компартмент, который состоит в основном из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), но также остеобластов, эндотелиальных клеток, макрофагов. В частности, подгруппы МСК играют разные роли в регуляции активности ГСК.

Лейкемические стволовые клетки — это небольшая подгруппа лейкемических клеток, способных к самообновлению и обладающих свойствами стволовости. По определению, эти клетки могут повторно инициировать лейкоз при трансплантации реципиенту.

Микроокружение костного мозга также взаимодействует с лейкемическими стволовыми клетками (ЛСК), изменяя их пролиферацию, адгезионные свойства, покой и клоновую экспансию.

В то же время исследования показали, что ЛСК могут репрограммировать МСК и получать трофическую поддержку, защиту от окислительного стресса и сохранение от токсичных химиотерапевтических агентов, способствуя формированию «лейкемической ниши». С другой стороны, МСК костного мозга взаимодействуют с ЛСК, прямо или косвенно, и изменяют пролиферацию, адгезионные свойства, покой и клоновую экспансию ЛСК. В результате МСК способствуют поддержанию ЛСК. Ремоделирование МСК является стратегией самообновления лейкемогенеза, которая могла бы объяснить клиническую гетерогенность и, таким образом, могла бы быть потенциальным прогностическим фактором.

Несколько исследований выявили наличие функциональных нарушений на уровне МСК костного мозга у пациентов с ОМЛ, таких как снижение пролиферации, увеличение апоптотической скорости и провоспалительное состояние.

Хотя микроокружение костного мозга, по-видимому, играет ключевую роль в развитии химиорезистентности при ОМЛ, остаётся неясным, связаны ли эти нарушения или другие с патогенезом лейкоза.

У пациентов с ОМЛ изменены характеристики МСК; в частности, наблюдается снижение количества примитивных МСК, определяемых как CD146+/nestin+, по сравнению со здоровыми донорами (ЗД). Nestin+ МСК костного мозга повышают выживаемость лейкемических клеток и химиорезистентность, стимулируя окислительное фосфорилирование и, таким образом, увеличивая выработку энергии. Эта субпопуляция, по-видимому, связана с течением заболевания: у пациентов с рецидивом наблюдается повышенный процент CD146+/nestin+ МСК по сравнению с субъектами в ремиссии.

Более того, модифицированные МСК по-разному взаимодействуют с ГСК и ЛСК, избирательно ингибируя нормальный гемопоэз и способствуя лейкемогенезу и химиорезистентности соответственно. Механизм стром-опосредованной защиты лейкемических клеток сложен и включает сеть цитокинов, хемокинов, растворимых факторов и микровезикул (МВ), которые способствуют пролиферации ЛСК. Вероятный механизм действия — взаимодействие между стромальными клетками костного мозга и ЛСК посредством высвобождения CXCL12 МСК и его связывания с рецептором CXCR4 на поверхности ЛСК. Более подробно, лейкемические клетки используют ось CXCL12/CXCR4 для хоминга в защитную нишу костного мозга, которая обычно ограничена для нормальных ГСК. В результате ЛСК находятся в среде, которая способствует их выживанию и защищает их от химиотерапии. По этой причине ось CXCL12/CXCR4 может быть мишенью для будущих методов лечения для предотвращения рецидивов.

Насколько нам известно, нет данных относительно характеристики микроокружения костного мозга при ОМЛ с мутацией NPM1. Характеристика МСК как наиболее репрезентативных компонентов микроокружения костного мозга может быть полезна для идентификации специфических клеточных механизмов, которые могли бы объяснить высокую частоту рецидивов, наблюдаемую у этих пациентов.

Цели исследования

Общая цель:

Охарактеризовать МСК костного мозга у субъектов, поражённых ОМЛ с мутацией NPM1, как возможные новые индикаторы клинического исхода пациента.

В частности, будут изучены фенотип, генетический профиль и функция МСК при ОМЛ, а также оценена их паракринная активность, чтобы понять механизмы, способствующие резистентности к терапии и возникновению рецидивов при ОМЛ с мутацией NPM1 на уровне микроокружения костного мозга. Паракринная активность МСК будет оценена посредством изучения и характеристики микровезикул, высвобождаемых МСК после депривации.

Первичная цель:

Первичной целью данного исследования является определение процентного содержания МСК CD146+ на момент диагностики, поскольку эта субпопуляция, по-видимому, участвует в создании ниши ЛСК и химиорезистентности. Было описано, что костный мозг пациентов с рецидивом показывает более высокий процент этой субпопуляции МСК по сравнению с пациентами, достигшими клинической ремиссии. Цель — продемонстрировать, что у пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 существует статистически значимая разница в процентном содержании МСК CD146+ (на момент диагностики) по сравнению с МСК ЗД и МСК контроля заболевания (МСК КЗ: пациенты с ОМЛ с диким типом NPM1).

Сопутствующая первичная цель:

Сравнение процентного содержания клеток CD146+ на момент диагностики и в различные моменты времени (диагностика, после индукции, окончание лечения, наблюдение, перед трансплантацией, рецидив) между пациентами с рецидивом и пациентами без рецидива во всей популяции (ОМЛ с мутацией NPM1 и ОМЛ с диким типом NPM1)

Вторичные цели:

1. Сравнить субпопуляцию МСК CD146+ у пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 и ОМЛ с диким типом NPM1 в каждый предопределённый момент времени.

2. Охарактеризовать МСК при ОМЛ у пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 по сравнению с ОМЛ с диким типом NPM1. В соответствии с международными рекомендациями по определению МСК (Dominici et al., 2006) будут оценены морфология, способность прилипать к пластику, клоногенная эффективность, пролиферативная способность и переход к старению.

   Экспрессия поверхностных маркеров CD105, CD73 и CD90 и отсутствие CD45, CD34, CD14, CD19 и HLA-DR будут оценены с помощью мечения моноклональными антителами и оценки с помощью многопараметрической проточной цитометрии (МПЦ) (FacsCanto II, Becton Dickinson). Экспрессия CD146 и nestin будет оценена на образцах, полученных в определённые моменты времени. Способность МСК при ОМЛ дифференцироваться в адипоциты и остеоциты будет определена после стимуляции in vitro соответствующими факторами дифференцировки.

3. Функциональная характеристика МСК от пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 по сравнению с ОМЛ с диким типом NPM1. Функциональные свойства МСК будут оценены путём разработки кокультуры МСК при ОМЛ в аутологичных условиях (мононуклеарные клетки периферической крови пациента (МКПК)/МСК пациента) и аллогенных условиях (МКПК здорового донора/МСК пациента). Затем будет оценен иммуномодулирующий потенциал, способность генерировать субпопуляции T-, B- и NK-клеток и регуляция оси CXCR4/CXCL12. Кроме того, будут количественно определены провоспалительные и регуляторные цитокины в супернатанте культуры.
4. Геномная характеристика МСК у пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 по сравнению с ОМЛ с диким типом NPM1 с использованием секвенирования нового поколения (NGS) с помощью панели генов, часто мутирующих при миелоидных новообразованиях.

Третичная исследовательская цель

• Сортировка субпопуляции МСК CD146+/nestin+ для будущих исследований in vitro в кокультуре
• Выделение и характеристика МВ, высвобождаемых МСК при ОМЛ после депривации.
• Разработка культур МКПК от ЗД с МВ для оценки их паракринной активности.

Дизайн исследования Это пилотное проспективное наблюдательное лонгитюдное исследование in vitro в одном центре

Субъекты и критерии включения Взрослые пациенты с впервые выявленным острым миелоидным лейкозом, диагностированные в Clinica Ematologica Фонда IRCCS Policlinico San Matteo в Павии.

Контрольную группу составляют здоровые доноры гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации костного мозга, включённые в Oncoematologia Pediatrica, после подписания информированного согласия

Сбор образцов Экспансия и анализ МСК костного мозга в выбранные моменты времени (диагностика, окончание индукции, окончание консолидации, наблюдение, перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), рецидив).

В те же моменты времени будет собран образец периферической крови. Каждый запланированный момент времени представляет собой стандартную клиническую практику аспирации костного мозга и забора крови.

Методы

Первичные и сопутствующие первичные цели:

Шестьдесят пациентов с впервые выявленным острым миелоидным лейкозом, диагностированных в Clinica Ematologica Фонда IRCCS Policlinico San Matteo в Павии, будут включены в течение трёх лет;

Первичная и сопутствующая первичная цель:

В качестве стандартной процедуры аспират костного мозга включённых пациентов будет собран на момент диагностики, окончания индукции, окончания консолидации, наблюдения, до и после ТГСК, рецидива.

МСК будут выделены из костного мозга субъектов с ОМЛ с мутацией NPM1 и ОМЛ с диким типом NPM1, а затем культивированы in vitro с 5% лизированной средой DMEM+ до старения.

Экспрессия поверхностных маркеров CD146 и nestin будет оценена с помощью внутрицитоплазматического мечения и последующего анализа с помощью МПЦ FacsCanto II (BD). Процентное содержание МСК CD146+/nestin+ на момент начала заболевания у пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 будет сравниваться с процентным содержанием у ЗД и контроля заболевания.

Вторичные цели:

Характеристика МСК костного мозга пациентов путём оценки клоногенной эффективности (колониеобразующие единицы фибробластов, CFU-f). Тем временем пролиферативная способность будет оценена в терминах кумулятивного популяционного удвоения (cPD). Старение МСК при ОМЛ будет определено как время, когда количество восстановленных клеток меньше или равно количеству культивированных клеток. Стареющие клетки будут обнаружены с использованием β-галактозидазы.

Способность МСК при ОМЛ дифференцироваться в адипоциты и остеоциты, стимулируемая добавлением специфических факторов in vitro: краситель ализарин красный специфически окрашивает липидные капли, тогда как краситель щелочной фосфатазы выделит наличие отложений кальция, типичных для остеоцитов.

В те же моменты времени будет собран образец периферической крови, остаток стандартных диагностических анализов, выполненных во время клинической деятельности. Из образца будут выделены МКПК и использованы в последующих экспериментах по иммуномодуляции.

Функциональные свойства МСК при ОМЛ будут оценены после кокультивирования с МКПК. После трёх дней инкубации способность МСК модулировать пролиферацию МКПК будет проанализирована с помощью включения титрованного тимидина. Результаты будут сравнены с полученными от МСК ЗД и контроля заболевания.

После десяти дней инкубации в той же культуре будет оценена способность МСК при ОМЛ регулировать процентное содержание субпопуляций лимфоцитов (T- и B-лимфоцитов и NK-клеток) с помощью МПЦ, наряду с процентным содержанием регуляторных T-клеток путём измерения внутрицитоплазматического Foxp3 и экспрессии CXCR4 на поверхности лимфоцитов пациентов. Супернатанты культур будут сохранены и использованы для дозирования CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 с помощью ELISA.

ДНК, выделенная из МСК субъектов с ОМЛ с мутацией NPM1 и ОМЛ с диким типом NPM1, будет проанализирована с помощью пользовательской панели TruSight Myeloid Sequencing Panel из 54 генов, секвенированной на Illumina MiSeq, вместе с ДНК, выделенной из лейкемических бластов тех же пациентов.

Третичная исследовательская цель Если процентное содержание МСК CD146+/nestin+ будет подходящим, эта субпопуляция будет отсортирована, и на ней будут выполнены вышеупомянутые анализы.

МВ будут выделены с помощью ультрацентрифугирования и количественно определены (NanoSight). Экспрессия поверхностных маркеров МВ будет оценена с помощью набора MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) и проточного цитометра MacsQuant (Miltenyi).

Белковый состав МВ будет оценен с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

Будут разработаны эксперименты по кокультивированию в присутствии МВ.

Сбор данных Данные будут зарегистрированы в электронной базе данных. Пациенты получат идентификационный код, обеспечивающий их конфиденциальность. Главный исследователь будет хранить отдельно список с идентификационными данными пациентов и соответствующим кодом.

Расчёт размера выборки Будет включено девяносто субъектов (60 пациентов: 30 ОМЛ с мутацией NPM1, 30 ОМЛ с диким типом NPM1 и 30 МСК ЗД). При таком размере выборки будет возможно обнаружить значимое попарное сравнение 2x2 post-hoc (двусторонняя ошибка I типа alpha=0,017) в уровнях МСК nestin+/CD146+ после однофакторного дисперсионного анализа, если разница между средними значениями составляет 85% от общего стандартного отклонения. Мощность 80% была принята во внимание.

Статистический анализ Качественные переменные будут описаны как абсолютные и относительные частоты каждой категории. Количественные переменные будут суммированы как среднее±стандартное отклонение или медиана и межквартильный размах. При необходимости будут приняты логарифмические преобразования данных.

Статистические анализы будут выполнены с использованием Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Статистический анализ для первичной конечной точки Уровни МСК nestin+/CD146+ на исходном уровне будут сравнены между тремя группами с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими попарными сравнениями 2x2 по Бонферрони.

Статистический анализ для сопутствующей первичной конечной точки Связь между уровнями МСК nestin+/CD146+ в различные моменты времени и рецидивом будет оценена с помощью совместной модели лонгитюдных данных и данных выживаемости.

Статистический анализ для вторичных конечных точек

1. Сравнение в соответствии с мутационным статусом NPM1 будет проведено путём подбора многоуровневых смешанных линейных или логистических моделей (с пациентами, рассматриваемыми как случайный эффект).
2. Взаимодействия между МСК и лейкемическими клетками будут проанализированы путём подбора многоуровневых смешанных линейных или логистических моделей (с пациентами, рассматриваемыми как случайный эффект).
3. Точный тест Фишера будет выполнен для сравнения пациентов с ОМЛ с мутацией NPM1 и ОМЛ с диким типом NPM1.

Статистический анализ для третичных исследовательских конечных точек Для третичных исследовательских конечных точек будут использованы описательные статистики.

Информированное согласие Каждый пациент получит информационные материалы исследования, и будет получено подписанное информированное согласие.

Информационный листок и информированное согласие разъяснят, что пациент не будет подвергаться дополнительным заборам крови и аспирациям костного мозга.