Células Madre Mesenquimales en la Leucemia Mieloide Aguda de Bajo Riesgo con Mutación NPM1: un Estudio del Microambiente Tumoral y su Contribución al Resultado

Antecedentes La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia hematológica heterogénea caracterizada por la expansión clonal y la detención de la diferenciación de las células progenitoras mieloides.

Aunque incompleto, el conocimiento actual de la patogénesis de la LMA ha permitido la estratificación de los pacientes en diferentes grupos pronósticos y ha conducido a la aparición de estrategias de tratamiento personalizadas.

La Red Europea de Leucemia (ELN) estratifica la LMA de novo en grupos de riesgo favorable, intermedio y adverso según las mutaciones genéticas y las anomalías cromosómicas. En particular, los pacientes con un perfil de riesgo favorable se caracterizan por la presencia de reordenamientos del factor de unión al núcleo (CBF), cariotipo normal con mutaciones de la nucleofosmina 1 (NPM1) y tipo salvaje del receptor de tirosina quinasa 3 relacionado con fms (FLT3), mutaciones de NPM1 y duplicación interna en tándem de FLT3 con baja relación alélica, o mutaciones bialélicas en el factor de unión a CCAAT/amplificador de unión proteica α (CEBPα).

A pesar del perfil de riesgo favorable, los pacientes en seguimiento a largo plazo tras quimioterapia convencional presentan tasas de recaída de hasta el 50% en LMA con mutación NPM1, 40% en LMA CBF y 44% en LMA con mutación bialélica de CEBPα. Estos datos resaltan la necesidad de una mayor investigación entre las LMA de riesgo favorable para obtener más conocimiento sobre los mecanismos patogénicos y de resistencia, mejorando así la estratificación de los pacientes. Además, estas perspectivas podrían conducir al descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas.

NPM1 es la mutación más frecuente en LMA, representando aproximadamente el 50-60% de las LMA de novo citogenéticamente normales. Estudios en ratones e in vivo han demostrado que la mutación NPM1 promueve la leucémogénesis y la mieloproliferación, pero no es suficiente para inducir leucemia. Las mutaciones preexistentes de las células madre hematopoyéticas (CMH) pueden ser un posible mecanismo que coopera en la leucémogénesis. Estas mutaciones involucran principalmente modificadores epigenéticos en células madre o progenitoras hematopoyéticas, resultando en su expansión clonal en individuos sin una enfermedad hematológica evidente. Esta condición, denominada hematopoyesis clonal, representa un estado preleucémico que puede promover la aparición de mutaciones capaces de impulsar la leucémogénesis. De hecho, las mutaciones de NPM1 frecuentemente se agrupan con mutaciones co-ocurrentes que involucran genes de las vías de señalización, metilación del ADN, empalme de ARN, complejo cohesina, transcripción génica y supresión tumoral.

Aunque pocos estudios han demostrado que algunas mutaciones co-ocurrentes afectan negativamente el pronóstico de la enfermedad, persisten controversias sobre su impacto real. Por lo tanto, el panorama mutacional por sí solo no puede explicar completamente los cursos clínicos de algunos pacientes en este grupo de leucemias de bajo riesgo; otros factores pueden desempeñar un papel en la heterogeneidad de este subgrupo de LMA. Recientemente, se han realizado grandes esfuerzos para obtener información sobre el nicho hematopoyético leucémico, que está implicado en la refractariedad y recaída de la enfermedad.

Las Células Madre Hematopoyéticas regulan sus procesos de proliferación, diferenciación y autorrenovación en un nicho específico de la médula ósea, a través de la interacción con el microambiente de la MO. El microambiente tiene un compartimento celular que consiste principalmente en células madre mesenquimales (MSC), pero también osteoblastos, células endoteliales, macrófagos. En particular, los subgrupos de MSC tienen diferentes roles en la regulación de la actividad de las CMH.

Las células madre leucémicas son un pequeño subgrupo de células leucémicas capaces de autorrenovación y con propiedades de stemness. Por definición, estas células pueden reiniciar la leucemia si se injertan en un huésped receptor.

El microambiente de la MO también interactúa con las células madre leucémicas (CML), alterando su proliferación, propiedades de adhesión, quiescencia y expansión clonal.

Al mismo tiempo, los estudios han demostrado que las CML pueden reprogramar las MSC y recibir soporte trófico, protección del estrés oxidativo y preservación de agentes quimioterapéuticos tóxicos, promoviendo la formación de un "nicho leucémico". Por otro lado, las MSC de la MO interactúan con las CML, directa o indirectamente, y alteran la proliferación, propiedades de adhesión, quiescencia y expansión clonal de las CML. Como resultado, las MSC contribuyen al mantenimiento de las CML. La remodelación de las MSC es una estrategia de autorrenovación de la leucémogénesis que podría explicar la heterogeneidad clínica y, por lo tanto, podría ser un factor pronóstico potencial.

Varios estudios han revelado la presencia de alteraciones funcionales a nivel de las MSC de la MO en pacientes con LMA, como disminución de la proliferación, aumento de la tasa apoptótica y un estado proinflamatorio.

Aunque el microambiente de la MO parece desempeñar un papel clave en la promoción de la quimiorresistencia en la LMA, si estas alteraciones u otras están relacionadas con la patogénesis de la leucemia aún no está claro.

Los pacientes con LMA tienen características alteradas de las MSC; en particular, hay una cantidad reducida de MSC primitivas, definidas como CD146+/nestina+, en comparación con donantes sanos (DS). Las MSC de la MO nestina+ mejoran la supervivencia de las células leucémicas y la quimiorresistencia estimulando la fosforilación oxidativa y, por lo tanto, aumentando la producción de energía. Esta subpoblación parece estar asociada con el curso de la enfermedad: los pacientes que recaen tienen un porcentaje mayor de MSC CD146+/nestina+ en comparación con los sujetos en remisión.

Además, las MSC modificadas interactúan de manera diferente con las CMH y las CML, inhibiendo selectivamente la hematopoyesis normal y promoviendo la leucémogénesis y la quimiorresistencia, respectivamente. El mecanismo de protección mediada por el estroma de las células leucémicas es complejo e implica una red de citoquinas, quimioquinas, factores solubles y microvesículas (MV) que promueven la proliferación de las CML. Un probable mecanismo de acción es la interacción entre las células del estroma de la MO y las CML a través de la liberación de CXCL12 por las MSC y su unión al receptor CXCR4 en la superficie de las CML. Más en detalle, las células leucémicas explotan el eje CXCL12/CXCR4 para homing en un nicho protector de la MO, que normalmente está restringido a las CMH normales. Como resultado, las CML residen en un entorno que promueve su supervivencia y las protege de la quimioterapia. Por esta razón, el eje CXCL12/CXCR4 podría ser dirigido por terapias futuras para prevenir recaídas.

Según nuestro conocimiento, no hay datos sobre la caracterización del microambiente de la MO en la LMA con mutación NPM1. La caracterización de las MSC, como los componentes más representativos del microambiente de la MO, podría ser útil para la identificación de mecanismos celulares específicos que podrían explicar la alta tasa de recaída observada en estos pacientes.

Objetivos del estudio

Objetivo general:

Caracterizar las MSC de la MO de sujetos afectados por LMA NPM1mut como posibles nuevos indicadores del resultado clínico del paciente.

En detalle, se estudiará el fenotipo, perfil genético y función de las MSC de LMA, y se evaluará su actividad paracrina para comprender los mecanismos que promueven la resistencia a la terapia y la ocurrencia de recaída en la LMA NPM1mut a nivel del microambiente de la médula ósea. La actividad paracrina de las MSC se evaluará mediante el estudio y caracterización de las microvesículas liberadas por las MSC después de la privación.

Objetivo Primario:

El objetivo primario de este estudio es la detección del porcentaje de MSC CD146+ al diagnóstico, ya que esta subpoblación parece estar involucrada en la creación del nicho de CML y la quimiorresistencia. Se ha descrito que la MO de pacientes recaídos muestra un mayor porcentaje de esta subpoblación de MSC en comparación con pacientes que alcanzan remisión clínica. El objetivo es demostrar que en pacientes con LMA NPM1mut hay una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de MSC CD146+ (al diagnóstico) en comparación con MSC de DS y MSC de control de enfermedad (MSC de pacientes con LMA NPM1 wt).

Objetivo coprimario:

Comparación del porcentaje de células CD146+ al diagnóstico y en diferentes puntos temporales (diagnóstico, post inducción, fin de tratamiento, seguimiento, pre-trasplante, recaída) entre pacientes recaídos y pacientes que no recaen en toda la población (LMA NPM1mut y LMA-NPM1wt)

Objetivos secundarios:

1. Comparar la subpoblación de MSC CD146+ en pacientes con LMA NPM1mut y LMA NPM1wt en cada punto temporal predefinido.

2. Caracterizar las MSC de LMA en pacientes con LMA NPM1mut vs LMA NPM1wt. Siguiendo las guías internacionales para la definición de MSC (Dominici et al., 2006), se evaluará la morfología, la capacidad de adhesión al plástico, la eficiencia clonogénica, la capacidad proliferativa y la transición a senescencia.

   La expresión de los marcadores de superficie CD105, CD73 y CD90 y la falta de CD45, CD34, CD14, CD19 y HLA-DR se evaluará mediante marcaje con anticuerpos monoclonales y evaluación mediante citometría de flujo multiparamétrica (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). La expresión de CD146 y nestina se evaluará en las muestras obtenidas en puntos temporales específicos. La capacidad de las MSC de LMA para diferenciarse en adipocitos y osteocitos se determinará después de la estimulación "in vitro" con los factores de diferenciación apropiados.

3. Caracterización funcional de las MSC de pacientes con LMA NPM1mut vs LMA NPM1wt. Las propiedades funcionales de las MSC se evaluarán mediante el desarrollo de un co-cultivo de MSC de LMA en el entorno autólogo (células mononucleares de sangre periférica del paciente (PBMC)/MSC del paciente) y alogénico (PBMC de donante sano/MSC del paciente). Luego se evaluará el potencial inmunomodulador, la capacidad de generar subpoblaciones de T, B y NK y la regulación del eje CXCR4/CXCL12. Además, se cuantificarán las citoquinas proinflamatorias y reguladoras en el sobrenadante del cultivo.
4. Caracterización genómica de las MSC en pacientes con LMA NPM1mut vs LMA-NPM1wt Utilizando secuenciación de próxima generación (NGS) con la ayuda de un panel de genes recurrentemente mutados en neoplasias mieloides.

Objetivo exploratorio terciario

• Ordenamiento de la subpoblación de MSC CD146+/nestina+ para futuros estudios de co-cultivo in vitro
• Aislamiento y caracterización de las MV liberadas por las MSC de LMA después de la privación.
• Desarrollo de cultivos de PBMC de DS con MV para evaluar su actividad paracrina.

Diseño del estudio Este es un estudio piloto observacional prospectivo longitudinal, in vitro, de un solo centro

Sujetos y criterios de inclusión Pacientes adultos con inicio nuevo de Leucemia Mieloide Aguda diagnosticados en la Clínica Hematológica de la Fundación IRCCS Policlínico San Matteo de Pavía.

Los controles son donantes sanos de células madre hematopoyéticas para trasplante de médula ósea inscritos por Oncohematología Pediátrica, tras firmar el consentimiento informado

Recolección de muestras Expansión y análisis de las MSC de médula ósea en puntos temporales seleccionados (diagnóstico, fin de inducción, fin de consolidación, seguimiento, antes del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), recaída).

En los mismos puntos temporales, se recolectará una muestra de sangre periférica. Cada punto temporal planificado representa una aspiración de médula ósea y recolección de sangre de práctica clínica ordinaria.

Métodos

Objetivos primarios y coprimarios:

Se inscribirán sesenta pacientes con inicio nuevo de Leucemia Mieloide Aguda diagnosticados en la Clínica Hematológica de la Fundación IRCCS Policlínico San Matteo de Pavía en tres años;

Objetivo primario y coprimario:

Como procedimiento estándar, la aspiración de médula ósea de los pacientes inscritos se recolectará al diagnóstico, fin de inducción, fin de consolidación, seguimiento, antes y después de HSCT, recaída.

Las MSC se aislarán de la médula ósea de sujetos con LMA NPM1mut y LMA-NPM1wt, y luego se cultivarán "in vitro" con medio de cultivo DMEM+ al 5% lisado hasta la senescencia.

La expresión de los marcadores de superficie CD146 y nestina se evaluará mediante marcaje intracitoplasmático y posterior análisis mediante MFC FacsCanto II (BD). Se comparará el porcentaje de MSC CD146+/nestina+ al inicio de la enfermedad en pacientes con LMA NPM1mut con el porcentaje de DS y controles de enfermedad.

Objetivos secundarios:

La caracterización de las MSC de la MO de los pacientes evaluando la eficiencia clonogénica (unidades formadoras de colonias, CFU-f). Mientras tanto, la capacidad proliferativa se evaluará en términos de duplicación acumulada de población (cPD). La senescencia de las MSC de LMA se definirá como el momento en que el número de células recuperadas es menor o igual al número de células cultivadas. Las células senescentes se detectarán utilizando β-galactosidasa.

La capacidad de las MSC de LMA para diferenciarse en adipocitos y osteocitos, impulsada por la adición de factores específicos in vitro: el colorante rojo de alizarina colorea específicamente las gotas lipídicas, mientras que el colorante de fosfatasa alcalina resaltará la presencia de depósitos de calcio, típicos de los osteocitos.

En los mismos puntos temporales, se recolectará una muestra de sangre periférica, un residuo de los análisis diagnósticos estándar realizados durante la actividad clínica. De la muestra se extraerán PBMC y se utilizarán en los experimentos de inmunomodulación posteriores.

Las propiedades funcionales de las MSC de LMA se evaluarán después del co-cultivo con PBMC. Después de tres días de incubación, la capacidad de las MSC para modular la proliferación de PBMC se analizará mediante la incorporación de Timidina Titulada. Los resultados se compararán con los obtenidos de MSC de DS y controles de enfermedad.

Después de diez días de incubación en el mismo cultivo, se evaluará la capacidad de las MSC de LMA para regular el porcentaje de las subpoblaciones linfocitarias (linfocitos T y B y células NK) mediante MFC, junto con el porcentaje de células T reguladoras mediante la medición de Foxp3 intracitoplasmático, y la expresión de CXCR4 en la superficie de los linfocitos de los pacientes. Los sobrenadantes del cultivo se almacenarán y utilizarán para dosificar CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 mediante ELISA.

El ADN extraído de las MSC de sujetos con LMA NPM1mut y LMA NPM1wt se analizará mediante un panel personalizado TruSight Myeloid Sequencing Panel de 54 genes secuenciados por Illumina MiSeq, junto con ADN extraído de blastos leucémicos de los mismos pacientes.

Objetivo exploratorio terciario Si el porcentaje de MSC CD146+/nestina+ es adecuado, esta subpoblación se ordenará y se realizarán los análisis mencionados anteriormente en ella.

Las MV se aislarán mediante ultracentrifugación y se cuantificarán (NanoSight). La expresión de los marcadores de superficie de las MV se evaluará mediante MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) y MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

El contenido proteico de las MV se evaluará mediante HPLC y espectrometría de masas.

Se desarrollarán experimentos de co-cultivo en presencia de MV.

Recolección de datos Los datos se registrarán en una base de datos electrónica. Los pacientes recibirán un código de identificación que garantice su privacidad. El investigador principal mantendrá por separado una lista con los datos de identificación del paciente y el código correspondiente.

Cálculo del tamaño de la muestra Se inscribirán noventa sujetos (60 pacientes: 30 LMA NPM1mut, 30 LMA NPM1wt y 30 MSC de DS). Con este tamaño de muestra será posible detectar una comparación post-hoc 2x2 significativa (error tipo I bilateral alfa=0.017) en los niveles de MSC nestina+/CD146+ después de un análisis de varianza de una vía si la diferencia entre medias es el 85% de la desviación estándar común. Se ha considerado una potencia del 80%.

Análisis estadístico Las variables cualitativas se describirán como frecuencias absolutas y relativas de cada categoría. Las variables cuantitativas se resumirán como media±desviación estándar, o por mediana y rango intercuartil. Si es necesario, se adoptarán transformaciones logarítmicas de los datos.

Los análisis estadísticos se realizarán utilizando Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Análisis estadístico para el criterio de valoración primario Los niveles de MSC nestina+/CD146+ al inicio se compararán entre tres grupos con análisis de varianza de una vía, seguido de comparaciones post-hoc 2x2 de Bonferroni.

Análisis estadístico para el criterio de valoración coprimario La asociación entre los niveles de MSC nestina+/CD146+ en diferentes puntos temporales y la recaída se evaluará mediante un modelo conjunto de datos longitudinales y de supervivencia.

Análisis estadístico para los criterios de valoración secundarios

1. La comparación según el estado mutacional de NPM1 se llevará a cabo ajustando modelos lineales o logísticos mixtos multinivel (con pacientes tratados como efecto aleatorio).
2. Las interacciones entre las MSC y las células leucémicas se analizarán ajustando modelos lineales o logísticos mixtos multinivel (con pacientes tratados como efecto aleatorio).
3. Se realizará la prueba exacta de Fisher para comparar pacientes con LMA NPM1mut vs LMA-NPM1wt.

Análisis estadístico para criterios de valoración exploratorios terciarios Para criterios de valoración exploratorios terciarios, se emplearán estadísticas descriptivas.

Consentimiento informado Cada paciente recibirá el material informativo del estudio y se obtendrá el formulario de consentimiento informado firmado.

Un folleto informativo y el consentimiento informado aclararán que el paciente no será sometido a extracciones de sangre y aspiraciones de médula ósea adicionales.