Mezenchymální kmenové buňky u NPM1 mutované nízkorizikové akutní myeloidní leukemie: studie nádorového mikroprostředí a jeho přínos k výsledku

Akutní myeloidní leukemie (AML) je heterogenní hematologická malignita charakterizovaná klonální expanzí a zastavením diferenciace myeloidních progenitorových buněk.

Ačkoli je současné poznání patogeneze AML neúplné, umožnilo stratifikaci pacientů do různých prognostických skupin a vedlo k rozvoji personalizovaných léčebných strategií.

European Leukemia Net (ELN) stratifikuje de novo AML podle genetických mutací a chromozomálních abnormalit do skupin příznivého, středního a nepříznivého rizika. Pacienti s příznivým rizikovým profilem jsou zejména charakterizováni přítomností přestaveb core-binding factor (CBF), normálním karyotypem s mutacemi nukleofosminu 1 (NPM1) a divokým typem fms related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3), mutacemi NPM1 a FLT3-internální tandemovou duplikací s nízkým alelickým poměrem nebo bialelickými mutacemi v CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPα).

Navzdory příznivému rizikovému profilu mají pacienti v dlouhodobém sledování po konvenční chemoterapii míry relapsu až 50 % u AML s mutací NPM1, 40 % u CBF AML a 44 % u AML s bialelickou mutací CEBPα. Tato data zdůrazňují potřebu dalšího výzkumu u AML s příznivým rizikem, aby bylo získáno více poznatků o patogenetických a rezistenčních mechanismech, a tím se zlepšila stratifikace pacientů. Tyto poznatky navíc mohou vést k objevení nových terapeutických cílů.

NPM1 je nejčastější mutací v AML, která se vyskytuje přibližně u 50–60 % de novo cytogeneticky normálních AML. Myší a in vivo studie prokázaly, že mutace NPM1 podporuje leukemogenezi a myeloproliferaci, ale není dostatečná k vyvolání leukemie. Předchozí mutace hematopoetických kmenových buněk (HSC) mohou být možným mechanismem, který spolupracuje v leukemogenezi. Tyto mutace se týkají zejména epigenetických modifikátorů v hematopoetických kmenových nebo progenitorových buňkách, což vede k jejich klonální expanzi u jedinců bez zjevného hematologického onemocnění. Tento stav, nazývaný klonální hematopoéza, představuje preleukemický stav, který může podporovat vznik mutací schopných řídit leukemogenezi. Mutace NPM1 se skutečně často vyskytují spolu s dalšími mutacemi zahrnujícími geny signalizačních drah, DNA methylace, RNA-splicingu, kohezního komplexu, transkripce genů a suprese nádorů.

Ačkoli několik studií ukázalo, že některé současně se vyskytující mutace negativně ovlivňují prognózu onemocnění, zůstávají kontroverze ohledně jejich skutečného dopadu. Mutacionální profil samotný tedy nemůže plně vysvětlit klinický průběh některých pacientů v této skupině leukemií s nízkým rizikem; další faktory mohou hrát roli v heterogenitě této podskupiny AML. V poslední době byly vynaloženy velké úsilí k získání poznatků o leukemické hematopoetické nice, která je spojena s refrakterností onemocnění a relapsem.

Hematopoetické kmenové buňky regulují své procesy proliferace, diferenciace a sebeobnovy ve specifické kostní dření nise prostřednictvím interakce s mikroprostředím kostní dřeně. Mikroprostředí má buněčnou složku, která se skládá hlavně z mezenchymálních kmenových buněk (MSC), ale také z osteoblastů, endoteliálních buněk, makrofágů. Zejména podskupiny MSC mají různé role v regulaci aktivity HSC.

Leukemické kmenové buňky jsou malou podskupinou leukemických buněk schopných sebeobnovy a s vlastnostmi kmenovosti. Podle definice mohou tyto buňky znovu iniciovat leukemii, pokud jsou transplantovány do hostitelského organismu.

Mikroprostředí kostní dřeně také interaguje s leukemickými kmenovými buňkami (LSC) a mění jejich proliferaci, adhezní vlastnosti, klidový stav a klonální expanzi.

Zároveň studie ukázaly, že LSC mohou přeprogramovat MSC a získávat trofickou podporu, ochranu před oxidačním stresem a ochranu před toxickými chemoterapeutiky, což podporuje tvorbu „leukemické niky“. Na druhé straně MSC kostní dřeně interagují s LSC přímo nebo nepřímo a mění proliferaci LSC, adhezní vlastnosti, klidový stav a klonální expanzi. V důsledku toho MSC přispívají k udržení LSC. Přestavba MSC je strategií sebeobnovy leukemogeneze, která by mohla vysvětlit klinickou heterogenitu, a tedy by mohla být potenciálním prognostickým faktorem.

Několik studií odhalilo přítomnost funkčních změn na úrovni BM-MSC u pacientů s AML, jako je snížená proliferace, zvýšená míra apoptózy a prozánětlivý stav.

Ačkoli se zdá, že mikroprostředí kostní dřeně hraje klíčovou roli v podpoře chemorezistence u AML, zda jsou tyto změny nebo jiné související s patogenezí leukemie, stále zůstává nejasné.

Pacienti s AML mají změněné charakteristiky MSC; zejména je snížené množství primitivních MSC, definovaných jako CD146+/nestin+, ve srovnání se zdravými dárci (HD). Nestin+ BM-MSC zlepšují přežití leukemických buněk a chemorezistenci stimulací oxidativní fosforylace a tím zvýšením produkce energie. Tato subpopulace se zdá být spojena s průběhem onemocnění: pacienti, kteří relabují, mají zvýšené procento CD146+/nestin+ MSC ve srovnání s osobami v remisi.

Navíc modifikované MSC interagují odlišně s HSC a LSC, selektivně inhibují normální hematopoézu a podporují leukemogenezi a chemorezistenci. Mechanismus stromálně zprostředkované ochrany leukemických buněk je složitý a zahrnuje síť cytokinů, chemokinů, rozpustných faktorů a mikrovezikul (MV), které podporují proliferaci LSC. Pravděpodobným mechanismem účinku je interakce mezi stromálními buňkami kostní dřeně a LSC prostřednictvím uvolňování CXCL12 MSC a jeho vazby na receptor CXCR4 na povrchu LSC. Podrobněji, leukemické buňky využívají osu CXCL12/CXCR4 pro homing v ochranné nise kostní dřeně, která je obvykle omezena na normální HSC. V důsledku toho LSC přebývají v prostředí, které podporuje jejich přežití a chrání je před chemoterapií. Z tohoto důvodu by mohla být osa CXCL12/CXCR4 cílem budoucích terapií k prevenci relapsů.

Pokud je nám známo, neexistují žádná data týkající se charakterizace mikroprostředí kostní dřeně u AML s mutací NPM1. Charakterizace MSC jako nejreprezentativnějších složek mikroprostředí kostní dřeně by mohla být užitečná pro identifikaci specifických buněčných mechanismů, které by mohly vysvětlit vysokou míru relapsu pozorovanou u těchto pacientů.

Cíle studie

Obecný cíl:

Charakterizovat BM-MSC subjektů postižených AML NPM1mut jako možné nové ukazatele klinického výsledku pacienta.

Podrobně bude studován fenotyp, genetický profil a funkce AML-MSC a bude hodnocena jejich parakrinní aktivita, aby bylo možné porozumět mechanismům, které podporují rezistenci k terapii a výskyt relapsu u AML NPM1mut na úrovni mikroprostředí kostní dřeně. Parakrinní aktivita MSC bude hodnocena studiem a charakterizací mikrovezikul uvolněných MSC po deprivaci.

Primární cíl:

Primárním cílem této studie je detekce procenta CD146+ MSC v době diagnózy, protože se zdá, že tato subpopulace je zapojena do tvorby niky LSC a chemorezistence. Bylo popsáno, že kostní dřeň relabovaných pacientů vykazuje vyšší procento této subpopulace MSC ve srovnání s pacienty v klinické remisi. Cílem je prokázat, že u pacientů s AML NPM1mut existuje statisticky významný rozdíl v procentu CD146+ MSC (v době diagnózy) ve srovnání s HD-MSC a DC-MSC (kontrolní MSC onemocnění: pacienti s AML NPM1 wt).

Společný primární cíl:

Srovnání procenta CD146+ buněk v době diagnózy a v různých časových bodech (diagnóza, po indukci, konec léčby, sledování, před transplantací, relaps) mezi relabovanými pacienty a pacienty, kteří nerelabují v celé populaci (AML NPM1mut a AML-NPM1wt)

Sekundární cíle:

1. Porovnat subpopulaci MSC CD146+ u pacientů s AML NPM1mut a AML NPM1wt v každém předem definovaném časovém bodě.

2. Charakterizovat AML-MSC u pacientů s AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Podle mezinárodních směrnic pro definici MSC (Dominici et al., 2006) bude hodnocena morfologie, schopnost adheze k plastu, klonogenní účinnost, proliferační kapacita a přechod do senescence.

   Exprese povrchových markerů CD105, CD73 a CD90 a absence CD45, CD34, CD14, CD19 a HLA-DR bude hodnocena značením monoklonálními protilátkami a hodnocením pomocí multiparametrické průtokové cytometrie (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). Exprese CD146 a nestinu bude hodnocena na vzorcích získaných v konkrétních časových bodech. Schopnost AML-MSC diferencovat se na adipocyty a osteocyty bude stanovena po „in vitro“ stimulaci příslušnými diferenciačními faktory.

3. Funkční charakterizace MSC od pacientů s AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Funkční vlastnosti MSC budou hodnoceny vývojem kokultury AML-MSC v autologním nastavení (periferní krevní mononukleární buňky pacienta (PBMC)/MSC pacienta) a alogenním (PBMC zdravého dárce/MSC pacienta). Poté bude hodnocen imunomodulační potenciál, schopnost generovat subpopulace T, B a NK buněk a regulace osy CXCR4/CXCL12. Dále budou kvantifikovány prozánětlivé a regulační cytokiny v supernatantu kultury.
4. Genomická charakterizace MSC u pacientů s AML NPM1mut vs AML-NPM1wt Pomocí sekvenování nové generace (NGS) s pomocí panelu genů často mutovaných v myeloidních neoplaziích.

Třetí explorativní cíl

• Třídění subpopulace CD146+/nestin+ MSC pro budoucí kokulturní in vitro studie
• Izolace a charakterizace MV uvolněných AML-MSC po deprivaci.
• Vývoj kultur PBMC od HD s MV za účelem hodnocení jejich parakrinní aktivity.

Design studie Toto je pilotní jednocentrová prospektivní observační, longitudinální, in vitro studie

Subjekty a inkluzní kritéria Dospělí pacienti s nově vzniklou akutní myeloidní leukemií diagnostikovanou na Klinice hematologie nadace IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Kontroly jsou zdraví dárci hematopoetických kmenových buněk pro transplantaci kostní dřeně zařazení Pediatrickou onkohematologií po podepsání informovaného souhlasu

Odběr vzorků Expanze a analýza kostní dřeně MSC ve vybraných časových bodech (diagnóza, konec indukce, konec konsolidace, sledování, před transplantací hematopoetických kmenových buněk (HSCT), relaps).

Ve stejných časových bodech bude odebrán vzorek periferní krve. Každý plánovaný časový bod představuje běžný klinický odběr kostní dřeně a krve.

Metody

Primární a společný primární cíle:

Za tři roky bude zařazeno šedesát pacientů s nově vzniklou akutní myeloidní leukemií diagnostikovanou na Klinice hematologie nadace IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia;

Primární a společný primární cíl:

Jako standardní postup bude odsátí kostní dřeně zařazených pacientů odebráno v době diagnózy, konce indukce, konce konsolidace, sledování, před a po HSCT, relapsu.

MSC budou izolovány z kostní dřeně subjektů s AML NPM1mut a AML-NPM1wt a poté kultivovány „in vitro“ s 5% lyzovaným DMEM+ kultivačním médiem až do senescence.

Exprese povrchových markerů CD146 a nestinu bude hodnocena intracelulárním značením a následnou analýzou pomocí MFC FacsCanto II (BD). Procento CD146+/nestin+ MSC v době nástupu onemocnění u pacientů s AML NPM1mut bude porovnáno s procentem HD a kontrol onemocnění.

Sekundární cíle:

Charakterizace BM-MSC pacientů hodnocením klonogenní účinnosti (kolonie tvořící jednotky, CFU-f). Mezitím bude proliferační kapacita hodnocena z hlediska kumulativního populačního zdvojení (cPD). Senescence AML-MSC bude definována jako čas, kdy počet získaných buněk je menší nebo roven počtu kultivovaných buněk. Senescentní buňky budou detekovány pomocí β-galaktosidázy.

Schopnost AML-MSC diferencovat se na adipocyty a osteocyty, řízená přidáním specifických faktorů in vitro: barvivo Alizarin red specificky barví lipidové kapénky, zatímco barvivo alkalické fosfatázy zvýrazní přítomnost kalciových depozit typických pro osteocyty.

Ve stejných časových bodech bude odebrán vzorek periferní krve, zbytek standardních diagnostických analýz provedených během klinické aktivity. Ze vzorku budou extrahovány PBMC a použity v následných imunomodulačních experimentech.

Funkční vlastnosti AML-MSC budou hodnoceny po kokultuře s PBMC. Po třech dnech inkubace bude schopnost MSC modulovat proliferaci PBMC analyzována inkorporací titrovaného thymidinu. Výsledky budou porovnány s výsledky získanými z HD-MSC a kontrol onemocnění.

Po deseti dnech inkubace ve stejné kultuře bude hodnocena schopnost AML-MSC regulovat procento subpopulací lymfocytů (T a B lymfocyty a NK buňky) pomocí MFC, spolu s procentem regulačních T buněk měřením intracelulárního Foxp3 a expresí CXCR4 na povrchu lymfocytů pacientů. Supernatanty kultur budou uskladněny a použity k dávkování CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 pomocí ELISA.

DNA extrahovaná z MSC subjektů s AML NPM1mut a AML NPM1wt bude analyzována pomocí vlastního panelu TruSight Myeloid Sequencing Panel 54 genů sekvenovaných Illumina MiSeq, spolu s DNA extrahovanou z leukemických blastů stejných pacientů.

Třetí explorativní cíl Pokud bude procento CD146+/nestin+ MSC vhodné, bude tato subpopulace tříděna a na ní budou provedeny výše uvedené analýzy.

MV budou izolovány ultracentrifugací a kvantifikovány (NanoSight). Exprese povrchových markerů MV bude hodnocena pomocí MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) a MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

Proteinový obsah MV bude hodnocen pomocí HPLC a hmotnostní spektrometrie.

Budou vyvinuty experimenty kokultury v přítomnosti MV.

Sběr dat Data budou zaznamenána v elektronické databázi. Pacienti obdrží identifikační kód, který zajišťuje jejich soukromí. Hlavní vyšetřovatel bude samostatně uchovávat seznam s identifikačními údaji pacienta a odpovídajícím kódem.

Výpočet velikosti vzorku Bude zařazeno devadesát subjektů (60 pacientů: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt a 30 HD-MSC). S touto velikostí vzorku bude možné detekovat významné 2x2 post-hoc srovnání (oboustranná chyba typu I alfa=0,017) v hladinách nestin+/CD146+ MSC po jednosměrné analýze rozptylu, pokud je rozdíl mezi průměry 85 % společného směrodatného odchylky. Byla uvažována síla 80 %.

Statistická analýza Kvalitativní proměnné budou popsány jako absolutní a relativní frekvence každé kategorie. Kvantitativní proměnné budou shrnuty jako průměr±směrodatná odchylka nebo medián a interkvartilové rozpětí. V případě potřeby budou použity logaritmické transformace dat.

Statistické analýzy budou provedeny pomocí Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Statistická analýza pro primární koncový bod Hladiny Nestin+/CD146+ MSC na začátku budou porovnány mezi třemi skupinami pomocí jednosměrné analýzy rozptylu, následované Bonferroniho 2x2 post-hoc srovnáními.

Statistická analýza pro společný primární koncový bod Asociace mezi hladinami nestin+/CD146+ MSC v různých časových bodech a relapsem bude hodnocena společným modelem longitudinálních a přežitostních dat.

Statistická analýza pro sekundární koncové body

1. Srovnání podle mutačního stavu NPM1 bude provedeno pomocí víceúrovňových smíšených (s pacienty jako náhodný efekt) lineárních nebo logistických modelů.
2. Interakce mezi MSC a leukemickými buňkami budou analyzovány pomocí víceúrovňových smíšených (s pacienty jako náhodný efekt) lineárních nebo logistických modelů.
3. Pro srovnání pacientů s AML NPM1mut vs AML-NPM1wt bude proveden Fisherův exaktní test.

Statistická analýza pro třetí explorativní koncové body Pro třetí explorativní koncové body budou použity deskriptivní statistiky.

Informovaný souhlas Každý pacient obdrží informační materiály studie a bude získán podepsaný formulář informovaného souhlasu.

Informační leták a informovaný souhlas objasní, že pacient nebude podroben dalším odběrům krve a odsátím kostní dřeně.