Mesenchymale stamceller i NPM1-muteret lavrisiko akut myeloid leukæmi: en undersøgelse af tumormikromiljøet og dets bidrag til udfaldet

Baggrund Akut myeloid leukæmi (AML) er en heterogen hematologisk malignitet karakteriseret ved klonal ekspansion og differentieringsstop i myeloide progenitorceller.

Selvom den er ufuldstændig, har nuværende viden om AML-patogenesen muliggjort patientstratificering i forskellige prognostiske grupper og har ført til fremkomsten af personlige behandlingsstrategier.

European Leukemia Net (ELN) stratificer de novo AML i gunstige, intermediære og ugunstige risikogrupper i henhold til genetiske mutationer og kromosomale abnormiteter. Især karakteriseres patienter med en gunstig risikoprofil af enten tilstedeværelsen af core-binding factor omarrangeringer (CBF), normal karyotype med nucleophosmin 1 (NPM1) mutationer og fms related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) wild-type, NPM1 mutationer og FLT3-internal tandem duplication med lav allelisk ratio, eller bialleliske mutationer i CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPα).

På trods af den gunstige risikoprofil har patienter i langtidsopfølgning efter konventionel kemoterapi tilbagefaldsrater på op til 50% i AML med NPM1 mutation, 40% i CBF AML og 44% i AML med CEBPα biallelisk mutation. Disse data fremhæver behovet for yderligere undersøgelse blandt gunstig-risiko AML for at opnå mere viden om patogenetiske og resistensmekanismer, og dermed forbedre patientstratificering. Desuden kunne disse indsigter føre til opdagelsen af nye terapeutiske mål.

NPM1 er den hyppigste mutation i AML, der udgør cirka 50-60% af de novo cytogenetisk normal AML. Musestudier og in vivo studier har vist, at NPM1 mutation fremmer leukæmogenese og myeloproliferation, men ikke er tilstrækkelig til at inducere leukæmi. Eksisterende mutationer i hematopoietiske stamceller (HSCs) kan være en mulig mekanisme, der samarbejder i leukæmogenese. Disse mutationer involverer hovedsageligt epigenetiske modifikatorer i hematopoietiske stam- eller progenitorceller, hvilket resulterer i deres klonale ekspansion hos individer uden en åbenlys hematologisk sygdom. Denne tilstand, kaldet klonal hematopoiese, repræsenterer en præleukæmisk tilstand, der kan fremme fremkomsten af mutationer i stand til at drive leukæmogenese. Faktisk optræder NPM1 mutationer ofte sammen med samtidige mutationer, der involverer gener i signalveje, DNA-methylering, RNA-splicing, cohesin-komplekset, gentranskription og tumorsuppression.

Selvom få studier har vist, at nogle samtidige mutationer påvirker sygdomsprognosen negativt, er der stadig kontroverser om deres reelle indflydelse. Derfor kan mutationslandskabet alene ikke fuldt ud forklare de kliniske forløb for nogle patienter i denne gruppe af lavrisikoleukæmier; andre faktorer kan spille en rolle i heterogeniteten af denne AML-undergruppe. For nylig er der blevet gjort store anstrengelser for at få indsigt i den leukæmiske hematopoietiske niche, som er involveret i sygdomsrefraktæritet og tilbagefald.

Hematopoietiske stamceller regulerer deres proliferation, differentiering og selvfornyelsesprocesser i en specifik knoglemarvsniche gennem interaktion med BM-mikromiljøet. Mikromiljøet har en cellulær kompartment, der hovedsageligt består af mesenchymale stamceller (MSCs), men også osteoblaster, endothelceller, makrofager. Især har MSC-undergrupper forskellige roller i reguleringen af HSCs aktivitet.

Leukæmiske stamceller er en lille undergruppe af leukæmiske celler i stand til selvfornyelse og med stamcelleegenskaber. Per definition kan disse celler genstarte leukæmi, hvis de transplanteres i en modtager. BM-mikromiljøet interagerer også med leukæmiske stamceller (LSCs) og ændrer deres proliferation, adhesions egenskaber, kviescens og klonale ekspansion.

Samtidig har studier vist, at LSCs kan reprogrammere MSCs og modtage trofisk støtte, beskyttelse mod oxidativt stress og beskyttelse mod toksiske kemoterapeutiske agenser, hvilket fremmer dannelsen af en "leukæmisk niche". På den anden side interagerer BM MSCs med LSCs, direkte eller indirekte, og ændrer LSCs' proliferation, adhesions egenskaber, kviescens og klonale ekspansion. Som et resultat bidrager MSCs til LSC-opretholdelse. MSC-remodellering er en leukæmogenese selvfornyelsesstrategi, der kunne forklare den kliniske heterogenitet og dermed kunne være en potentiel prognostisk faktor.

Flere studier har afsløret tilstedeværelsen af funktionelle ændringer på BM-MSCs niveau hos patienter med AML, såsom nedsat proliferation, forøget apoptotisk rate og en proinflammatorisk tilstand.

Selvom BM-mikromiljøet synes at spille en nøglerolle i at fremme kemoresistens i AML, er det stadig uklart, om disse ændringer eller andre er relateret til leukæmipatogenese.

Patienter med AML har ændrede MSCs karakteristika; især er der en reduceret mængde primitive MSCs, defineret som CD146+/nestin+, sammenlignet med raske donorer (HD). Nestin+ BM-MSCs forbedrer leukæmisk celles overlevelse og kemoresistens ved at stimulere oxidativ fosforylering og dermed øge energi produktion. Denne subpopulation synes at være associeret med sygdomsforløbet: patienter, der får tilbagefald, har en forøget procentdel af CD146+/nestin+ MSCs i forhold til personer i remission.

Desuden interagerer modificerede MSCs forskelligt med HSC og LSC, hvilket selektivt hæmmer normal hematopoiese og fremmer leukæmogenese og kemoresistens, henholdsvis. Mekanismen for stromamedieret beskyttelse af leukæmiske celler er kompleks og involverer et netværk af cytokiner, kemokiner, opløselige faktorer og mikrovehikler (MVs), der fremmer LSCs proliferation. En sandsynlig virkningsmekanisme er interaktionen mellem BM stromalceller og LSCs gennem frigivelse af CXCL12 af MSCs og dets binding til CXCR4 receptoren på overfladen af LSCs. Mere detaljeret udnytter leukæmiske celler CXCL12/CXCR4 aksen for homing i en beskyttende BM niche, som normalt er begrænset til normale HSC. Som et resultat opholder LSCs sig i et miljø, der fremmer deres overlevelse og beskytter dem mod kemoterapi. Af denne grund kunne CXCL12/CXCR4 aksen være mål for fremtidige terapier for at forebygge tilbagefald.

Så vidt vi ved, er der ingen data vedrørende karakteriseringen af BM-mikromiljøet i NPM1-muteret AML. Karakteriseringen af MSCs, som de mest repræsentative komponenter af BM-mikromiljøet, kunne være nyttig til identificering af specifikke cellulære mekanismer, der kunne forklare den høje tilbagefaldsrate observeret hos disse patienter.

Studiets mål

Generelt mål:

At karakterisere BM-MSCs hos personer påvirket af AML NPM1mut som mulige nye indikatorer for patientens kliniske udfald.

I detaljer vil AML-MSCs' fenotype, genetiske profil og funktion blive studeret, og deres parakrine aktivitet vil blive evalueret for at forstå mekanismerne, der fremmer resistens mod terapi og tilbagefald i AML NPM1mut på niveauet af knoglemarvs-mikromiljøet. MSCs' parakrine aktivitet vil blive vurderet gennem undersøgelse og karakterisering af de mikrovehikler, der frigives af MSCs efter deprivation.

Primært mål:

Det primære mål for dette studie er påvisning af CD146+ MSCs procentdel ved diagnose, da denne subpopulation synes at være involveret i LSC niche-dannelse og kemoresistens. Det er blevet beskrevet, at BM hos patienter med tilbagefald viser højere procentdel af denne MSC subpopulation sammenlignet med patienter, der gennemgår klinisk remission. Målet er at demonstrere, at der hos AML NPM1mut patienter er en statistisk signifikant forskel i CD146+ MSC procentdel (ved diagnose) sammenlignet med HD-MSCs og DC-MSCs (sygdomskontrol MSCs: AML patienter NPM1 wt).

Co-primært mål:

Sammenligning af procentdelen af CD146+ celler ved diagnose og på forskellige tidspunkter (diagnose, efter induktion, behandlingsafslutning, opfølgning, før transplantation, tilbagefald) mellem patienter med tilbagefald og patienter, der ikke får tilbagefald i hele populationen (AML NPM1mut og AML-NPM1wt)

Sekundære mål:

1. Sammenlign MSCs CD146+ subpopulationen i AML NPM1mut og AML NPM1wt patienter på hvert foruddefinerede tidspunkt.

2. Karakteriser AML-MSCs hos patienter med AML NPM1mut vs AML NPM1wt. I henhold til de internationale retningslinjer for definition af MSCs (Dominici et al., 2006), vil morfologi, evnen til at hæfte til plast, den klonogene effektivitet, den proliferative kapacitet og overgangen til senescens blive evalueret.

   Udtrykket af overflademarkører CD105, CD73 og CD90 og fraværet af CD45, CD34, CD14, CD19 og HLA-DR vil blive evalueret gennem mærkning med monoklonale antistoffer og vurdering ved hjælp af multiparametrisk flowcytometri (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). CD146 og nestin udtryk vil blive vurderet på prøverne opnået på specifikke tidspunkter. AML-MSCs' evne til at differentiere til adipocytter og osteocytter vil blive bestemt efter "in vitro" stimulation med de passende differentieringsfaktorer.

3. Funktionel karakterisering af MSCs fra AML NPM1mut vs AML NPM1wt patienter. MSCs' funktionelle egenskaber vil blive evalueret gennem udvikling af en co-culture af AML-MSCs i autolog setting (patientens perifere blod mononukleære celler (PBMCs)/patientens MSCs) og allogen en (sund donors PBMCs/patientens MSCs). Derefter vil det immunmodulerende potentiale, evnen til at generere T, B og NK subpopulationer og reguleringen af CXCR4/CXCL12 aksen blive vurderet. Desuden vil de proinflammatoriske og regulatoriske cytokiner i kultur supernatantet blive kvantificeret.
4. Genomisk karakterisering af MSCs hos patienter med AML NPM1mut vs AML-NPM1wt Ved brug af next generation sequencing (NGS) med hjælp fra et panel af gener, der hyppigt muteres i myeloide neoplasi.

Tertiært eksplorativt mål

• Sortering af CD146+/nestin+ MSCs subpopulationen til fremtidige co-culture in vitro studier
• Isolering og karakterisering af de MVs frigivet af AML-MSCs efter deprivation.
• Udvikling af kulturer af PBMCs fra HD med MVs for at evaluere deres parakrine aktivitet.

Studiedesign Dette er et pilot, single center, prospektivt observations-, longitudinelt, in vitro studie

Deltagere og inklusionskriterier Voksne patienter med nystartet Akut Myeloid Leukæmi diagnosticeret på Clinica Ematologica af Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Kontrollerne er raske donorer af hematopoietiske stamceller til knoglemarvstransplantation indskrevet af Oncoematologia Pediatrica, efter underskrivelse af informeret samtykke

Indsamling af prøver Ekspansion og analyse af knoglemarvs MSCs på udvalgte tidspunkter (diagnose, slutning af induktion, slutning af konsolidering, opfølgning, før hematopoietisk stamcellestransplantation (HSCT), tilbagefald).

På samme tidspunkter vil en perifer blodprøve blive indsamlet. Hvert planlagte tidspunkt repræsenterer en almindelig klinisk praksis knoglemarvsaspiration og blodindsamling.

Metoder

Primære og co-primære mål:

Tres patienter med nystartet Akut Myeloid Leukæmi diagnosticeret på Clinica Ematologica af Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo i Pavia vil blive indskrevet over tre år;

Primært og co-primært mål:

Som standardprocedure vil knoglemarvsaspirationen af indskrevne patienter blive indsamlet ved diagnose, slutning af induktion, slutning af konsolidering, opfølgning, før og efter HSCT, tilbagefald.

MSCs vil blive isoleret fra knoglemarven hos AML NPM1mut og AML-NPM1wt personer og derefter kultiveret "in vitro" med 5% lyst DMEM+ kulturmedium indtil senescens.

Udtrykket af overflademarkørerne CD146 og nestin vil blive evalueret gennem intracellulær mærkning og efterfølgende analyse gennem MFC FacsCanto II (BD). Procentdelen af CD146+/nestin+ MSCs ved sygdomsstart hos patienter med AML NPM1mut vil blive sammenlignet med procentdelen af HD og sygdomskontroller.

Sekundære mål:

Karakterisering af patienternes BM-MSCs ved at evaluere den klonogene effektivitet (colony forming units, CFU-f). Imens vil den proliferative kapacitet blive vurderet i form af kumulativ populations fordobling (cPD). Senescens af AML-MSCs vil blive defineret som det tidspunkt, hvor antallet af genvundne celler er mindre eller lig med antallet af kultiverede celler. Senescente celler vil blive påvist ved brug af β-galaktosidase.

AML-MSCs' evne til at differentiere til adipocytter og osteocytter, drevet af tilføjelse af specifikke faktorer in vitro: Alizarin red farve farver specifikt lipid dråber, hvorimod alkalisk fosfatase farve vil fremhæve tilstedeværelsen af calciumaflejringer, typisk for osteocytter.

På samme tidspunkter vil en perifer blodprøve blive indsamlet, en rest af de standarddiagnostiske analyser udført under klinisk aktivitet. Fra prøven vil PBMCs blive ekstraheret og brugt i de efterfølgende immunmodulationseksperimenter.

AML-MSCs' funktionelle egenskaber vil blive evalueret efter co-culture med PBMCs. Efter tre dages inkubation vil MSCs' evne til at modulere PBMCs' proliferation blive analyseret gennem inkorporering af Titreret Thymidin. Resultaterne vil blive sammenlignet med dem opnået fra HD-MSC og sygdomskontroller.

Efter ti dages inkubation i samme kultur vil kapaciteten af AML-MSCs til at regulere procentdelen af lymfocyt subpopulationer (T- og B-lymfocytter og NK-celler) gennem MFC blive evalueret sammen med procentdelen af T-regulatoriske celler gennem måling af intracellulært Foxp3 og udtrykket af CXCR4 på overfladen af patienternes lymfocytter. Kultur supernatantet vil blive opbevaret og brugt til at dosere CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 ved hjælp af ELISA.

DNA ekstraheret fra MSCs hos personer med AML NPM1mut og AML NPM1wt vil blive analyseret gennem en tilpasset TruSight Myeloid Sequencing Panel af 54 gener sekventeret af Illumina MiSeq, sammen med DNA ekstraheret fra leukæmiske blaster fra de samme patienter.

Tertiært eksplorativt mål Hvis procentdelen CD146+/nestin+ MSCs er egnet, vil denne subpopulation blive sorteret, og ovennævnte analyser vil blive udført på den.

MVs vil blive isoleret gennem ultracentrifugering og kvantificeret (NanoSight). Udtrykket af MVs overflademarkører vil blive vurderet gennem MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) og MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

Proteinindholdet af MVs vil blive evalueret gennem HPLC og massespektrometri.

Co-culture eksperimenter i nærvær af MVs vil blive udviklet.

Dataindsamling Data vil blive registreret i en elektronisk database. Patienter vil modtage en identifikationskode, der sikrer deres privatliv. PI vil separat opbevare en liste med patientens identifikationsdata og den tilsvarende kode.

Stikprøvestørrelsesberegning Halvfems personer vil blive indskrevet (60 patienter: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt og 30 HD-MSCs). Med denne stikprøvestørrelse vil det være muligt at detektere en signifikant 2x2 post-hoc sammenligning (tosidet type I fejl alfa=0,017) i nestin+/CD146+ MSCs niveauer efter envejs variansanalyse, hvis forskellen mellem middelværdier er 85% af den fælles standardafvigelse. En styrke på 80% er blevet overvejet.

Statistisk analyse Kvalitative variable vil blive beskrevet som absolutte og relative frekvenser for hver kategori. Kvantitative variable vil blive opsummeret som middelværdi±standardafvigelse eller ved median og interkvartilområde. Hvis nødvendigt vil log-transformationer af data blive anvendt.

Statistiske analyser vil blive udført ved brug af Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Statistisk analyse for primært endpoint Nestin+/CD146+ MSCs niveauer ved baseline vil blive sammenlignet mellem tre grupper med envejs variansanalyse, efterfulgt af Bonferronis 2x2 post-hoc sammenligninger.

Statistisk analyse for co-primært endpoint Associationen mellem nestin+/CD146+ MSCs niveauer på forskellige tidspunkter og tilbagefald vil blive evalueret ved en joint model af longitudinelle og overlevelsesdata.

Statistisk analyse for sekundære endpoints

1. Sammenligningen i henhold til NPM1 mutationsstatus vil blive udført ved at tilpasse multilevel mixed (med patienter behandlet som random effekt) lineære eller logistiske modeller.
2. Interaktionerne mellem MSCs og leukæmiske celler vil blive analyseret ved at tilpasse multilevel mixed (med patienter behandlet som random effekt) lineære eller logistiske modeller.
3. Fishers eksakte test vil blive udført for at sammenligne patienter med AML NPM1mut vs AML-NPM1wt.

Statistisk analyse for tertiære eksplorative endpoints For tertiære eksplorative endpoints vil deskriptiv statistik blive anvendt.

Informeret samtykke Hver patient vil modtage studiet informativt materiale, og underskrevet informeret samtykkeformular vil blive opnået.

En informationsfolder og informeret samtykke vil klargøre, at patienten ikke vil blive underlagt yderligere blodprøver og knoglemarvsaspirationer.