Mesenkymala stamceller i NPM1-muterad lågrisk akut myeloisk leukemi: en studie av tumörmikromiljön och dess bidrag till utfallet

Bakgrund Akut myeloisk leukemi (AML) är en heterogen hematologisk malignitet som kännetecknas av klonal expansion och differentieringsarrest av myeloida progenitorceller.

Trots att den nuvarande kunskapen om AML-patogenes är ofullständig har den möjliggjort patientstratifiering i olika prognostiska grupper och lett till framväxten av personliga behandlingsstrategier.

European Leukemia Net (ELN) stratifierar de novo AML i gynnsamma, intermediära och ogynnsamma riskgrupper enligt genetiska mutationer och kromosomala abnormiteter. Särskilt patienter med en gynnsam riskprofil kännetecknas av antingen förekomst av core-binding factor-omarrangemang (CBF), normalt karyotyp med nukleofosmin 1 (NPM1)-mutationer och fms-relaterad receptor tyrosinkinas 3 (FLT3) vildtyp, NPM1-mutationer och FLT3-intern tandemduplikation med låg allelisk kvot, eller biallela mutationer i CCAAT/förstärkningsbindande protein α (CEBPα).

Trots den gynnsamma riskprofilen har patienter i långtidsuppföljning efter konventionell kemoterapi återfallsrisker på upp till 50 % vid AML med NPM1-mutation, 40 % vid CBF AML och 44 % vid AML med CEBPα biallela mutation. Dessa data belyser behovet av ytterligare undersökningar bland gynnsam risk AML för att få mer kunskap om patogenetiska och resistensmekanismer, och därmed förbättra patientstratifiering. Dessutom kan dessa insikter leda till upptäckten av nya terapeutiska mål.

NPM1 är den vanligaste mutationen vid AML, vilket utgör cirka 50–60 % av de novo cytogenetiskt normal AML. Studier på möss och in vivo har visat att NPM1-mutation främjar leukemogenes och myeloproliferation men inte är tillräcklig för att inducera leukemi. Tidigare existerande mutationer i hematopoietiska stamceller (HSC) kan vara en möjlig mekanism som samverkar i leukemogenes. Dessa mutationer involverar huvudsakligen epigenetiska modifierare i hematopoietiska stam- eller progenitorceller, vilket resulterar i deras klonala expansion hos individer utan en uppenbar hematologisk sjukdom. Detta tillstånd, kallat klonal hematopoies, representerar ett preleukemiskt tillstånd som kan främja uppkomsten av mutationer som kan driva leukemogenes. NPM1-mutationer klustrar faktiskt ofta med samtidigt förekommande mutationer som involverar gener i signaleringsvägar, DNA-metylering, RNA-splicing, cohesinkomplex, gentranskription och tumörsuppression.

Även om få studier har visat att vissa samtidigt förekommande mutationer negativt påverkar sjukdomsprognosen, kvarstår kontroverser om deras verkliga inverkan. Därför kan mutationslandskapet ensamt inte fullt ut förklara de kliniska förloppen hos vissa patienter i denna grupp av lågriskleukemier; andra faktorer kan spela en roll i heterogeniteten hos denna AML-subgrupp. Nyligen har stora ansträngningar gjorts för att få insikter om den leukemiska hematopoietiska nischen, som är inblandad i sjukdomsrefraktäritet och återfall.

Hematopoietiska stamceller reglerar sina proliferations-, differentierings- och självförnyelseprocesser i en specifik benmärgsnisch, genom interaktion med BM-mikromiljön. Mikromiljön har en cellulär kompartiment som huvudsakligen består av mesenkymala stamceller (MSC), men även osteoblaster, endotelceller, makrofager. Särskilt har MSC-subgrupper olika roller i regleringen av HSC-aktivitet.

Leukemiska stamceller är en liten undergrupp av leukemiska celler som kan självförnya sig och med stamcellsegenskaper. Per definition kan dessa celler återinitiera leukemi om de transplanteras till en mottagarvärd.

BM-mikromiljön interagerar också med leukemiska stamceller (LSC), vilket förändrar deras proliferation, adhesionsförmåga, viloläge och klonala expansion.

Samtidigt har studier visat att LSC kan omprogrammera MSC och erhålla trofiskt stöd, skydd mot oxidativ stress och bevarande från toxiska kemoterapeutiska ämnen, vilket främjar bildandet av en "leukemisk nisch". Å andra sidan interagerar BM-MSC med LSC, direkt eller indirekt, och förändrar LSC:s proliferation, adhesionsförmåga, viloläge och klonala expansion. Som ett resultat bidrar MSC till LSC-underhåll. MSC-omformning är en leukemogenes självförnyelsestrategi som skulle kunna förklara den kliniska heterogeniteten och därmed kunna vara en potentiell prognostisk faktor.

Flera studier har avslöjat förekomst av funktionella förändringar på BM-MSC-nivå hos patienter med AML, såsom minskad proliferation, ökad apoptoshastighet och ett proinflammatoriskt tillstånd.

Även om BM-mikromiljön verkar spela en nyckelroll i att främja kemoresistens vid AML, förblir det oklart om dessa förändringar eller andra är relaterade till leukemipatogenes.

Patienter med AML har förändrade MSC-egenskaper; särskilt finns det en minskad mängd primitiva MSC, definierade som CD146+/nestin+, jämfört med friska donatorer (HD). Nestin+ BM-MSC förbättrar överlevnad och kemoresistens hos leukemiska celler genom att stimulera oxidativ fosforylering och därmed öka energiproduktionen. Denna subpopulation verkar vara associerad med sjukdomsförloppet: patienter som återfaller har en ökad procentandel CD146+/nestin+ MSC jämfört med individer i remission.

Dessutom interagerar modifierade MSC annorlunda med HSC och LSC, selektivt inhiberar normal hematopoies och främjar leukemogenes respektive kemoresistens. Mekanismen för stromamedierad skydd av leukemiska celler är komplex och involverar ett nätverk av cytokiner, kemokiner, lösta faktorer och mikrovehiklar (MV) som främjar LSC-proliferation. En trolig verkningsmekanism är interaktionen mellan BM-stromaceller och LSC genom frisättning av CXCL12 från MSC och dess bindning till CXCR4-receptorn på ytan av LSC. Mer detaljerat utnyttjar leukemiska celler CXCL12/CXCR4-axeln för hemning i en skyddande BM-nisch, som vanligtvis är begränsad till normal HSC. Som ett resultat vistas LSC i en miljö som främjar deras överlevnad och skyddar dem från kemoterapi. Av denna anledning kan CXCL12/CXCR4-axeln vara mål för framtida terapier för att förhindra återfall.

Enligt vår vetskap finns det inga data om karakterisering av BM-mikromiljön vid NPM1-muterad AML. Karakterisering av MSC, som de mest representativa komponenterna i BM-mikromiljön, skulle kunna vara användbar för identifiering av specifika cellulära mekanismer som kan förklara den höga återfallsrisken som observerats hos dessa patienter.

Studiens mål

Generellt mål:

Att karakterisera BM-MSC hos individer drabbade av AML NPM1mut som möjliga nya indikatorer för patientens kliniska utfall.

Detaljerat kommer AML-MSC:s fenotyp, genetiska profil och funktion att studeras, och deras parakrina aktivitet kommer att utvärderas för att förstå mekanismerna som främjar resistens mot terapi och återfallsförekomst vid AML NPM1mut på nivån av benmärgsmikromiljön. Den parakrina aktiviteten hos MSC kommer att bedömas genom studier och karakterisering av mikrovehiklarna som frisätts av MSC efter deprivation.

Primärt mål:

Det primära målet med denna studie är detektion av CD146+ MSC-procentandel vid diagnos, eftersom denna subpopulation verkar vara inblandad i LSC-nischskapande och kemoresistens. Det har beskrivits att BM hos återfallspatienter visar högre procentandel av denna MSC-subpopulation jämfört med patienter som genomgår klinisk remission. Målet är att visa att hos AML NPM1mut-patienter finns en statistiskt signifikant skillnad i CD146+ MSC-procentandel (vid diagnos) jämfört med HD-MSC och DC-MSC (sjukdomskontroll MSC: AML-patienter NPM1 wt).

Ko-primärt mål:

Jämförelse av procentandelen CD146+ celler vid diagnos och vid olika tidpunkter (diagnos, efter induktion, behandlingens slut, uppföljning, före transplantation, återfall) mellan återfallspatienter och patienter som inte återfaller i hela populationen (AML NPM1mut och AML-NPM1wt)

Sekundära mål:

1. Jämför MSC CD146+ subpopulationen hos AML NPM1mut- och AML NPM1wt-patienter vid varje fördefinierad tidpunkt.

2. Karakterisera AML-MSC hos patienter med AML NPM1mut vs AML NPM1wt. Enligt de internationella riktlinjerna för definition av MSC (Dominici et al., 2006) kommer morfologi, förmåga att fästa vid plast, klonogen effektivitet, proliferativ kapacitet och övergång till åldrande att utvärderas.

   Uttrycket av ytmarkörerna CD105, CD73 och CD90 och avsaknaden av CD45, CD34, CD14, CD19 och HLA-DR kommer att utvärderas genom märkning med monoklonala antikroppar och bedömning med multiparametrisk flödescytometri (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). CD146- och nestinuttryck kommer att bedömas på proverna som erhållits vid specifika tidpunkter. AML-MSC:s förmåga att differentiera till adipocyter och osteocyter kommer att bestämmas efter "in vitro"-stimulering med lämpliga differentieringsfaktorer.

3. Funktionell karakterisering av MSC från AML NPM1mut vs AML NPM1wt-patienter. MSC:s funktionella egenskaper kommer att utvärderas genom utveckling av en kokultur av AML-MSC i autolog miljö (patientens perifera blodmononukleära celler (PBMC)/patientens MSC) och allogen miljö (frisk donators PBMC/patientens MSC). Sedan kommer det immunmodulerande potentialen, förmågan att generera T-, B- och NK-subpopulationer och regleringen av CXCR4/CXCL12-axeln att bedömas. Dessutom kommer de proinflammatoriska och regulatoriska cytokinerna i kulturöverständet att kvantifieras.
4. Genomisk karakterisering av MSC hos patienter med AML NPM1mut vs AML-NPM1wt Genom användning av next generation sequencing (NGS) med hjälp av ett panel av gener som återkommande muteras vid myeloida neoplasi.

Tertiärt explorativt mål

• Sortering av CD146+/nestin+ MSC-subpopulationen för framtida kokultur in vitro-studier
• Isolering och karakterisering av MV som frisätts av AML-MSC efter deprivation.
• Utveckling av kulturer av PBMC från HD med MV för att utvärdera deras parakrina aktivitet.

Studiedesign Detta är en pilotstudie, enkelt centrerad prospektiv observationell, longitudinell, in vitro-studie

Deltagare och inklusionskriterier Vuxna patienter med nydebuterad akut myeloisk leukemi diagnostiserade vid Clinica Ematologica av Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Kontrollerna är friska donatorer av hematopoietiska stamceller för benmärgstransplantation inskrivna av Oncoematologia Pediatrica, efter undertecknande av informerat samtycke

Insamling av prover Expansion och analys av benmärgens MSC vid utvalda tidpunkter (diagnos, induktionens slut, konsolideringens slut, uppföljning, före transplantation av hematopoietiska stamceller (HSCT), återfall).

Vid samma tidpunkter kommer ett perifert blodprov att samlas in. Varje planerad tidpunkt representerar en ordinär klinisk praxis benmärgsaspirat och blodinsamling.

Metoder

Primära och ko-primära mål:

Sextio patienter med nydebuterad akut myeloisk leukemi diagnostiserade vid Clinica Ematologica av Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo i Pavia kommer att rekryteras under tre år;

Primärt och ko-primärt mål:

Som standardprocedur kommer benmärgsaspiratet av inskrivna patienter att samlas in vid diagnos, induktionens slut, konsolideringens slut, uppföljning, före och efter HSCT, återfall.

MSC kommer att isoleras från benmärgen hos AML NPM1mut- och AML-NPM1wt-individer och sedan odlas "in vitro" med 5 % lyst DMEM+ odlingsmedium tills åldrande.

Uttrycket av ytmarkörerna CD146 och nestin kommer att utvärderas genom intracellulär märkning och efterföljande analys genom MFC FacsCanto II (BD). Procentandelen CD146+/nestin+ MSC vid sjukdomsdebut hos patienter med AML NPM1mut kommer att jämföras med procentandelen hos HD och sjukdomskontroller.

Sekundära mål:

Karakterisering av patienternas BM-MSC genom att utvärdera klonogen effektivitet (kolonibildande enheter, CFU-f). Samtidigt kommer den proliferativa kapaciteten att bedömas i termer av kumulativ populationsfördubbling (cPD). Åldrande av AML-MSC kommer att definieras som den tidpunkt då antalet återvunna celler är mindre än eller lika med antalet odlade celler. Åldrande celler kommer att detekteras genom användning av β-galaktosidas.

AML-MSC:s förmåga att differentiera till adipocyter och osteocyter, driven av tillsats av specifika faktorer in vitro: Alizarinrött färgämne färgar specifikt lipiddroppar, medan det alkaliskafosfatasfärgämnet kommer att framhäva förekomsten av kalciumavlagringar, typiska för osteocyter.

Vid samma tidpunkter kommer ett perifert blodprov att samlas in, en rest av de standarddiagnostiska analyserna som utförs under klinisk verksamhet. Från provet kommer PBMC att extraheras och användas i de efterföljande immunmodulationsexperimenten.

AML-MSC:s funktionella egenskaper kommer att utvärderas efter kokultur med PBMC. Efter tre dagars inkubering kommer MSC:s förmåga att modulera PBMC:s proliferation att analyseras genom inkorporering av titrerad tymidin. Resultaten kommer att jämföras med de som erhållits från HD-MSC och sjukdomskontroller.

Efter tio dagars inkubering i samma kultur kommer kapaciteten hos AML-MSC att reglera procentandelen av lymfocytsubpopulationerna (T- och B-lymfocyter och NK-celler) genom MFC att utvärderas, tillsammans med procentandelen T-regulatoriska celler genom mätning av intracellulärt Foxp3, och uttrycket av CXCR4 på ytan av patienternas lymfocyter. Kulturöverständen kommer att lagras och användas för att dosera CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 med hjälp av ELISA.

DNA som extraherats från MSC hos individer med AML NPM1mut och AML NPM1wt kommer att analyseras genom en anpassad TruSight Myeloid Sequencing Panel av 54 gener sekvenserade av Illumina MiSeq, tillsammans med DNA extraherat från leukemiska blaster från samma patienter.

Tertiärt explorativt mål Om procentandelen CD146+/nestin+ MSC är lämplig kommer denna subpopulation att sorteras och ovan nämnda analyser på den att utföras.

MV kommer att isoleras genom ultracentrifugering och kvantifieras (NanoSight). Uttrycket av MV-ytmarkörer kommer att bedömas genom MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) och MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi).

Proteininnehållet i MV kommer att utvärderas genom HPLC och masspektrometri.

Kokulturexperiment i närvaro av MV kommer att utvecklas.

Datainsamling Data kommer att registreras i en elektronisk databas. Patienter kommer att få en identifieringskod som säkerställer deras integritet. PI kommer att förvara separat en lista med patientens identifierande data och motsvarande kod.

Beräkning av urvalsstorlek Nittio individer kommer att rekryteras (60 patienter: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt och 30 HD-MSC). Med denna urvalsstorlek kommer det att vara möjligt att detektera en signifikant 2x2 post-hoc jämförelse (tvåsidigt typ I-fel alfa=0,017) i nestin+/CD146+ MSC-nivåer efter envägs variansanalys om skillnaden mellan medelvärden är 85 % av den gemensamma standardavvikelsen. En styrka på 80 % har beaktats.

Statistisk analys Kvalitativa variabler kommer att beskrivas som absoluta och relativa frekvenser av varje kategori. Kvantitativa variabler kommer att sammanfattas som medelvärde±standardavvikelse, eller genom median och interkvartilavstånd. Vid behov kommer logtransformationer av data att användas.

Statistiska analyser kommer att utföras med Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Statistisk analys för den primära slutpunkten Nestin+/CD146+ MSC-nivåer vid baseline kommer att jämföras mellan tre grupper med envägs variansanalys, följt av Bonferronis 2x2 post-hoc jämförelser.

Statistisk analys för den ko-primära slutpunkten Associationen mellan nestin+/CD146+ MSC-nivåer vid olika tidpunkter och återfall kommer att utvärderas med en gemensam modell av longitudinella och överlevnadsdata.

Statistisk analys för de sekundära slutpunkterna

1. Jämförelsen enligt NPM1-mutationsstatus kommer att genomföras genom att anpassa flernivåblandade (med patienter behandlade som slumpmässig effekt) linjära eller logistiska modeller.
2. Interaktionerna mellan MSC och leukemiska celler kommer att analyseras genom att anpassa flernivåblandade (med patienter behandlade som slumpmässig effekt) linjära eller logistiska modeller.
3. Fisher's exakta test kommer att utföras för att jämföra patienter med AML NPM1mut vs AML-NPM1wt.

Statistisk analys för tertiära explorativa slutpunkter För tertiära explorativa slutpunkter kommer deskriptiv statistik att användas.

Informerat samtycke Varje patient kommer att få studiens informationsmaterial och undertecknat informerat samtyckesformulär kommer att erhållas.

Ett informationsblad och informerat samtycke kommer att klargöra att patienten inte kommer att utsättas för ytterligare blodprovstagningar och benmärgsaspirat.