Mesenchymale Stammzellen bei NPM1-mutiertem Niedrigrisiko-Akuter Myeloischer Leukämie: Eine Studie zur Tumormikroumgebung und ihrem Beitrag zum Behandlungsergebnis

Hintergrund Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene hämatologische Malignität, die durch klonale Expansion und Differenzierungsarrest myeloischer Vorläuferzellen gekennzeichnet ist.

Obwohl unvollständig, hat das aktuelle Wissen über die AML-Pathogenese eine Stratifizierung der Patienten in verschiedene prognostische Gruppen ermöglicht und zum Aufkommen personalisierter Behandlungsstrategien geführt.

Das European Leukemia Net (ELN) stratifiziert de-novo-AML anhand genetischer Mutationen und chromosomaler Abnormalitäten in günstige, intermediäre und ungünstige Risikogruppen. Insbesondere Patienten mit einem günstigen Risikoprofil sind durch das Vorhandensein von Core-Binding-Factor-Rearrangements (CBF), normalem Karyotyp mit Nucleophosmin-1-(NPM1)-Mutationen und fms-related receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) Wildtyp, NPM1-Mutationen und FLT3-internal tandem duplication mit niedrigem Allelverhältnis oder biallelischen Mutationen in CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein α (CEBPα) gekennzeichnet.

Trotz des günstigen Risikoprofils haben Patienten in der Langzeitnachbeobachtung nach konventioneller Chemotherapie Rückfallraten von bis zu 50 % bei AML mit NPM1-Mutation, 40 % bei CBF-AML und 44 % bei AML mit CEBPα-biallelischer Mutation. Diese Daten unterstreichen die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen bei günstigem Risiko-AML, um mehr Wissen über die pathogenetischen und Resistenzmechanismen zu gewinnen und somit die Patientenschichtung zu verbessern. Darüber hinaus könnten diese Erkenntnisse zur Entdeckung neuer therapeutischer Ziele führen.

NPM1 ist die häufigste Mutation bei AML und macht etwa 50–60 % der de-novo-zyrogenetisch normalen AML aus. Maus- und In-vivo-Studien haben gezeigt, dass die NPM1-Mutation die Leukämogenese und Myeloproliferation fördert, aber nicht ausreicht, um Leukämie zu induzieren. Vorbestehende Mutationen hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) könnten ein möglicher Mechanismus sein, der bei der Leukämogenese zusammenwirkt. Diese Mutationen betreffen hauptsächlich epigenetische Modifikatoren in hämatopoetischen Stamm- oder Vorläuferzellen, was zu deren klonaler Expansion bei Personen ohne offensichtliche hämatologische Erkrankung führt. Dieser Zustand, der als klonale Hämatopoese bezeichnet wird, stellt einen präleukämischen Zustand dar, der das Auftreten von Mutationen fördern kann, die die Leukämogenese antreiben. Tatsächlich treten NPM1-Mutationen häufig zusammen mit koexistierenden Mutationen auf, die Gene der Signalwege, DNA-Methylierung, RNA-Spleißen, Cohesin-Komplex, Gentranskription und Tumorsuppression betreffen.

Obwohl einige Studien gezeigt haben, dass einige koexistierende Mutationen die Krankheitsprognose negativ beeinflussen, bestehen Kontroversen über deren tatsächliche Auswirkung. Daher kann die Mutationslandschaft allein die klinischen Verläufe einiger Patienten in dieser Gruppe von Niedrigrisiko-Leukämien nicht vollständig erklären; andere Faktoren könnten eine Rolle bei der Heterogenität dieser AML-Subgruppe spielen. In jüngster Zeit wurden große Anstrengungen unternommen, um Einblicke in die leukämische hämatopoetische Nische zu gewinnen, die an der Krankheitsrefraktärität und dem Rückfall beteiligt ist.

Hämatopoetische Stammzellen regulieren ihre Proliferation, Differenzierung und Selbsterneuerungsprozesse in einer spezifischen Knochenmarknische durch die Interaktion mit der BM-Mikroumgebung. Die Mikroumgebung hat eine zelluläre Komponente, die hauptsächlich aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) besteht, aber auch Osteoblasten, Endothelzellen, Makrophagen umfasst. Insbesondere haben MSC-Subgruppen unterschiedliche Rollen bei der Regulation der HSC-Aktivität.

Leukämiestammzellen sind eine kleine Untergruppe leukämischer Zellen, die zur Selbsterneuerung fähig sind und Stammzelleigenschaften besitzen. Per Definition können diese Zellen Leukämie re-initiiieren, wenn sie in einen Empfängerwirt transplantiert werden.

Die BM-Mikroumgebung interagiert ebenfalls mit leukämischen Stammzellen (LSCs) und verändert deren Proliferation, Adhäsionseigenschaften, Ruhezustand und klonale Expansion.

Gleichzeitig haben Studien gezeigt, dass LSCs die MSCs umprogrammieren und trophische Unterstützung, Schutz vor oxidativem Stress und Bewahrung vor toxischen chemotherapeutischen Agenzien erhalten können, was die Bildung einer „leukämischen Nische“ fördert. Andererseits interagieren die BM-MSCs direkt oder indirekt mit LSCs und verändern deren Proliferation, Adhäsionseigenschaften, Ruhezustand und klonale Expansion. Infolgedessen tragen die MSCs zur LSC-Erhaltung bei. MSC-Remodellierung ist eine Leukämogenese-Selbsterneuerungsstrategie, die die klinische Heterogenität erklären könnte und somit ein potenzieller prognostischer Faktor sein könnte.

Mehrere Studien haben das Vorhandensein funktioneller Veränderungen auf der BM-MSC-Ebene bei Patienten mit AML aufgezeigt, wie verminderte Proliferation, erhöhte Apoptoserate und ein proinflammatorischer Zustand.

Obwohl die BM-Mikroumgebung eine Schlüsselrolle bei der Förderung der Chemoresistenz in AML zu spielen scheint, bleibt unklar, ob diese Veränderungen oder andere mit der Leukämiepathogenese zusammenhängen.

Patienten mit AML haben veränderte MSC-Charakteristika; insbesondere gibt es eine reduzierte Menge primitiver MSCs, definiert als CD146+/nestin+, im Vergleich zu gesunden Spendern (HD). Nestin+ BM-MSCs verbessern das Überleben leukämischer Zellen und die Chemoresistenz durch Stimulierung der oxidativen Phosphorylierung und somit Erhöhung der Energieproduktion. Diese Subpopulation scheint mit dem Krankheitsverlauf assoziiert zu sein: Patienten, die einen Rückfall erleiden, haben einen erhöhten Prozentsatz an CD146+/nestin+ MSCs im Vergleich zu Personen in Remission.

Darüber hinaus interagieren modifizierte MSCs unterschiedlich mit HSC und LSC, hemmen selektiv die normale Hämatopoese und fördern jeweils Leukämogenese und Chemoresistenz. Der Mechanismus der stromavermittelten Protektion leukämischer Zellen ist komplex und umfasst ein Netzwerk von Zytokinen, Chemokinen, löslichen Faktoren und Mikrovesikeln (MVs), die die LSC-Proliferation fördern. Ein wahrscheinlicher Wirkmechanismus ist die Interaktion zwischen BM-Stromazellen und LSCs durch die Freisetzung von CXCL12 durch MSCs und dessen Bindung an den CXCR4-Rezeptor auf der Oberfläche von LSCs. Genauer gesagt nutzen leukämische Zellen die CXCL12/CXCR4-Achse für die Homing in eine schützende BM-Nische, die normalerweise auf normale HSC beschränkt ist. Infolgedessen verweilen LSCs in einer Umgebung, die ihr Überleben fördert und sie vor Chemotherapie schützt. Aus diesem Grund könnte die CXCL12/CXCR4-Achse von zukünftigen Therapien angesteuert werden, um Rückfälle zu verhindern.

Unseres Wissens gibt es keine Daten bezüglich der Charakterisierung der BM-Mikroumgebung bei NPM1-mutierter AML. Die Charakterisierung von MSCs als die repräsentativsten Komponenten der BM-Mikroumgebung könnte für die Identifizierung spezifischer zellulärer Mechanismen nützlich sein, die die hohe Rückfallrate bei diesen Patienten erklären könnten.

Studienziele

Allgemeines Ziel:

Die BM-MSCs von an AML NPM1mut erkrankten Personen als mögliche neue Indikatoren des klinischen Patientenoutcomes zu charakterisieren.

Im Detail werden der AML-MSC-Phänotyp, das genetische Profil und die Funktion untersucht und ihre parakrine Aktivität bewertet, um die Mechanismen zu verstehen, die die Resistenz gegen Therapie und das Auftreten von Rückfällen bei AML NPM1mut auf Ebene der Knochenmarkmikroumgebung fördern. Die parakrine Aktivität der MSCs wird durch die Untersuchung und Charakterisierung der nach Deprivation freigesetzten Mikrovesikel bewertet.

Primäres Ziel:

Das primäre Ziel dieser Studie ist die Detektion des CD146+ MSC-Prozentsatzes bei Diagnose, da diese Subpopulation an der LSC-Nischenbildung und Chemoresistenz beteiligt zu sein scheint. Es wurde beschrieben, dass das BM von rückfälligen Patienten einen höheren Prozentsatz dieser MSC-Subpopulation im Vergleich zu Patienten in klinischer Remission aufweist. Das Ziel ist der Nachweis, dass bei AML NPM1mut-Patienten ein statistisch signifikanter Unterschied im CD146+ MSC-Prozentsatz (bei Diagnose) im Vergleich zu HD-MSCs und DC-MSCs (Krankheitskontroll-MSCs: AML-Patienten NPM1 wt) besteht.

Ko-primäres Ziel:

Vergleich des Prozentsatzes von CD146+ Zellen bei Diagnose und zu verschiedenen Zeitpunkten (Diagnose, nach Induktion, Ende der Behandlung, Nachbeobachtung, vor Transplantation, Rückfall) zwischen rückfälligen Patienten und Patienten, die in der Gesamtpopulation (AML NPM1mut und AML-NPM1wt) keinen Rückfall erleiden.

Sekundäre Ziele:

1. Vergleichen der MSC CD146+ Subpopulation bei AML NPM1mut- und AML NPM1wt-Patienten zu jedem vordefinierten Zeitpunkt.

2. Charakterisieren von AML-MSCs bei Patienten mit AML NPM1mut vs. AML NPM1wt. Gemäß den internationalen Richtlinien zur Definition von MSCs (Dominici et al., 2006) werden die Morphologie, die Fähigkeit zur Plastikadhäsion, die klonogene Effizienz, die proliferative Kapazität und der Übergang zur Seneszenz bewertet.

   Die Expression der Oberflächenmarker CD105, CD73 und CD90 und das Fehlen von CD45, CD34, CD14, CD19 und HLA-DR werden durch Markierung mit monoklonalen Antikörpern und Bewertung mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson) evaluiert. Die CD146- und Nestin-Expression wird an den zu spezifischen Zeitpunkten gewonnenen Proben bewertet. Die Fähigkeit der AML-MSCs, sich zu Adipozyten und Osteozyten zu differenzieren, wird nach „in vitro“-Stimulation mit den entsprechenden Differenzierungsfaktoren bestimmt.

3. Funktionelle Charakterisierung von MSCs von AML NPM1mut- vs. AML NPM1wt-Patienten. Die funktionellen Eigenschaften der MSCs werden durch die Entwicklung einer Kokultur von AML-MSCs im autologen Setting (Patienten-periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs)/Patienten-MSCs) und allogenen Setting (gesunder Spender-PBMCs/Patienten-MSCs) evaluiert. Dann wird das immunmodulierende Potenzial, die Fähigkeit zur Generierung von T-, B- und NK-Subpopulationen und die Regulation der CXCR4/CXCL12-Achse bewertet. Darüber hinaus werden die proinflammatorischen und regulatorischen Zytokine im Kulturüberstand quantifiziert.
4. Genomische Charakterisierung der MSCs bei Patienten mit AML NPM1mut vs. AML-NPM1wt mittels Next-Generation-Sequencing (NGS) unter Verwendung eines Panels von Genen, die bei myeloischen Neoplasien wiederkehrend mutiert sind.

Tertiäres exploratives Ziel

• Sortieren der CD146+/nestin+ MSC-Subpopulation für zukünftige Kokultur-In-vitro-Studien
• Isolierung und Charakterisierung der nach Deprivation von AML-MSCs freigesetzten MVs.
• Entwicklung von Kulturen von PBMCs von HD mit MVs, um deren parakrine Aktivität zu bewerten.

Studiendesign Dies ist eine pilotierte, monozentrische, prospektive, beobachtende, longitudinale In-vitro-Studie.

Probanden und Einschlusskriterien Erwachsene Patienten mit neu aufgetretener Akuter Myeloischer Leukämie, diagnostiziert an der Clinica Ematologica der Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Die Kontrollen sind gesunde Spender hämatopoetischer Stammzellen für Knochenmarktransplantation, rekrutiert von der Oncoematologia Pediatrica, nach Unterzeichnung der Einwilligungserklärung.

Probenentnahme Expansion und Analyse der Knochenmark-MSCs zu ausgewählten Zeitpunkten (Diagnose, Ende der Induktion, Ende der Konsolidierung, Nachbeobachtung, vor hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSCT), Rückfall).

Zu denselben Zeitpunkten wird eine periphere Blutprobe entnommen. Jeder geplante Zeitpunkt stellt eine Knochenmarkaspiration und Blutentnahme im Rahmen der üblichen klinischen Praxis dar.

Methoden

Primäres und ko-primäres Ziel:

Sechzig Patienten mit neu aufgetretener Akuter Myeloischer Leukämie, diagnostiziert an der Clinica Ematologica der Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia, werden über drei Jahre eingeschlossen;

Primäres und ko-primäres Ziel:

Als Standardverfahren wird die Knochenmarkaspiration der eingeschlossenen Patienten bei Diagnose, Ende der Induktion, Ende der Konsolidierung, Nachbeobachtung, vor und nach HSCT, Rückfall entnommen.

Die MSCs werden aus dem Knochenmark von AML NPM1mut- und AML-NPM1wt-Subjekten isoliert und dann „in vitro“ mit 5 % lysiertem DMEM+ Kulturmedium bis zur Seneszenz kultiviert.

Die Expression der Oberflächenmarker CD146 und Nestin wird durch intrazytoplasmatische Markierung und anschließende Analyse mittels MFC FacsCanto II (BD) evaluiert. Der Prozentsatz von CD146+/nestin+ MSCs bei Krankheitsbeginn bei Patienten mit AML NPM1mut wird mit dem Prozentsatz von HD- und Krankheitskontrollen verglichen.

Sekundäre Ziele:

Die Charakterisierung der BM-MSCs der Patienten durch Bewertung der klonogenen Effizienz (koloniebildende Einheiten, CFU-f). Gleichzeitig wird die proliferative Kapazität in Form von kumulativer Populationsverdopplung (cPD) bewertet. Seneszenz von AML-MSCs wird definiert als der Zeitpunkt, wenn die Anzahl der zurückgewonnenen Zellen kleiner oder gleich der Anzahl der kultivierten Zellen ist. Seneszente Zellen werden durch Verwendung von β-Galaktosidase detektiert.

Die Fähigkeit der AML-MSCs, sich zu Adipozyten und Osteozyten zu differenzieren, angetrieben durch Zugabe spezifischer Faktoren in vitro: Der Alizarinrot-Farbstoff färbt spezifisch Lipidtröpfchen, während der alkalische Phosphatase-Farbstoff das Vorhandensein von Kalziumablagerungen, typisch für Osteozyten, hervorheben wird.

Zu denselben Zeitpunkten wird eine periphere Blutprobe entnommen, ein Rest der standardmäßigen diagnostischen Analysen, die während der klinischen Aktivität durchgeführt werden. Aus der Probe werden PBMCs extrahiert und in den nachfolgenden Immunmodulationsexperimenten verwendet.

Die funktionellen Eigenschaften der AML-MSCs werden nach Kokultur mit PBMCs evaluiert. Nach drei Tagen Inkubation wird die Fähigkeit der MSCs, die PBMC-Proliferation zu modulieren, durch Einbau von titriertem Thymidin analysiert. Die Ergebnisse werden mit denen von HD-MSC und Krankheitskontrollen verglichen.

Nach zehn Tagen Inkubation in derselben Kultur wird die Fähigkeit der AML-MSCs, den Prozentsatz der Lymphozyten-Subpopulationen (T- und B-Lymphozyten und NK-Zellen) durch MFC zu regulieren, zusammen mit dem Prozentsatz der regulatorischen T-Zellen durch Messung von intrazytoplasmatischem Foxp3 und der Expression von CXCR4 auf der Oberfläche der Patientenlymphozyten bewertet. Die Kulturüberstände werden gelagert und zur Quantifizierung von CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 mittels ELISA verwendet.

Die aus den MSCs von Subjekten mit AML NPM1mut und AML NPM1wt extrahierte DNA wird mittels eines kundenspezifischen TruSight Myeloid Sequencing Panels von 54 Genen, sequenziert durch Illumina MiSeq, zusammen mit der aus leukämischen Blasten derselben Patienten extrahierten DNA analysiert.

Tertiäres exploratives Ziel Wenn der Prozentsatz CD146+/nestin+ MSCs geeignet ist, wird diese Subpopulation sortiert und die oben genannten Analysen daran durchgeführt.

Die MVs werden durch Ultrazentrifugation isoliert und quantifiziert (NanoSight). Die Expression von MV-Oberflächenmarkern wird mittels MACSPlex Exosomes Kit (Miltenyi) und MacsQuant Flow Cytometer (Miltenyi) bewertet.

Der Proteingehalt der MVs wird durch HPLC und Massenspektrometrie evaluiert.

Kokultur-Experimente in Gegenwart von MVs werden entwickelt.

Datenerfassung Daten werden in einer elektronischen Datenbank aufgezeichnet. Patienten erhalten einen Identifikationscode, der ihre Privatsphäre gewährleistet. Der PI wird separat eine Liste mit Patientendaten und dem entsprechenden Code führen.

Stichprobenumfangsberechnung Neunzig Subjekte werden eingeschlossen (60 Patienten: 30 AML NPM1mut, 30 AML NPM1wt und 30 HD-MSCs). Mit dieser Stichprobengröße wird es möglich sein, einen signifikanten 2x2 Post-hoc-Vergleich (zweiseitiger Typ-I-Fehler alpha=0,017) in Nestin+/CD146+ MSC-Levels nach einfacher Varianzanalyse zu detektieren, wenn die Differenz zwischen den Mittelwerten 85 % der gemeinsamen Standardabweichung beträgt. Eine Power von 80 % wurde berücksichtigt.

Statistische Analyse Qualitative Variablen werden als absolute und relative Häufigkeiten jeder Kategorie beschrieben. Quantitative Variablen werden als Mittelwert±Standardabweichung oder durch Median und Interquartilsbereich zusammengefasst. Bei Bedarf werden Log-Transformationen der Daten angewendet.

Statistische Analysen werden mit Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.) durchgeführt.

Statistische Analyse für den primären Endpunkt Nestin+/CD146+ MSC-Levels zu Baseline werden zwischen drei Gruppen mit einfacher Varianzanalyse verglichen, gefolgt von Bonferroni 2x2 Post-hoc-Vergleichen.

Statistische Analyse für den ko-primären Endpunkt Die Assoziation zwischen Nestin+/CD146+ MSC-Levels zu verschiedenen Zeitpunkten und Rückfall wird durch ein gemeinsames Modell von Längsschnitt- und Überlebensdaten bewertet.

Statistische Analyse für die sekundären Endpunkte

1. Der Vergleich nach NPM1-Mutationsstatus wird durch Anpassung von mehrstufigen gemischten (mit Patienten als zufälliger Effekt) linearen oder logistischen Modellen durchgeführt.
2. Die Interaktionen zwischen MSCs und leukämischen Zellen werden durch Anpassung von mehrstufigen gemischten (mit Patienten als zufälliger Effekt) linearen oder logistischen Modellen analysiert.
3. Der exakte Test nach Fisher wird durchgeführt, um Patienten mit AML NPM1mut vs. AML-NPM1wt zu vergleichen.

Statistische Analyse für tertiäre explorative Endpunkte Für tertiäre explorative Endpunkte werden deskriptive Statistiken verwendet.

Einwilligungserklärung Jeder Patient erhält das Studieninformationsmaterial und eine unterzeichnete Einwilligungserklärung wird eingeholt.

Ein Informationsblatt und die Einwilligungserklärung werden klarstellen, dass der Patient keinen zusätzlichen Blutentnahmen und Knochenmarkaspirationen unterzogen wird.