Cellules Souches Mésenchymateuses dans la Leucémie Myéloïde Aiguë à Faible Risque avec Mutation NPM1 : une Étude du Microenvironnement Tumoral et de sa Contribution au Pronostic

Contexte La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une hémopathie maligne hétérogène caractérisée par une expansion clonale et un arrêt de la différenciation des progéniteurs myéloïdes.

Bien qu'incomplète, la connaissance actuelle de la pathogenèse de la LAM a permis la stratification des patients en différents groupes pronostiques et a conduit à l'émergence de stratégies de traitement personnalisées.

Le Réseau Européen de la Leucémie (ELN) stratifie la LAM de novo en groupes de risque favorable, intermédiaire et défavorable selon les mutations génétiques et les anomalies chromosomiques. En particulier, les patients avec un profil de risque favorable sont caractérisés par la présence de réarrangements du facteur liant le cœur (CBF), un caryotype normal avec des mutations de la nucléophosmine 1 (NPM1) et du récepteur tyrosine kinase 3 apparenté au fms (FLT3) de type sauvage, des mutations NPM1 et une duplication en tandem interne du FLT3 avec un faible rapport allélique, ou des mutations bialléliques du CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPα).

Malgré le profil de risque favorable, les patients en suivi à long terme après chimiothérapie conventionnelle présentent des taux de rechute allant jusqu'à 50 % dans la LAM avec mutation NPM1, 40 % dans la LAM CBF, et 44 % dans la LAM avec mutation biallélique CEBPα. Ces données soulignent la nécessité d'études complémentaires parmi les LAM de risque favorable pour mieux comprendre les mécanismes pathogéniques et de résistance, améliorant ainsi la stratification des patients. De plus, ces connaissances pourraient mener à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

NPM1 est la mutation la plus fréquente dans la LAM, représentant environ 50-60 % des LAM de novo cytogénétiquement normales. Des études murines et in vivo ont démontré que la mutation NPM1 favorise la leucémogenèse et la myéloprolifération mais n'est pas suffisante pour induire une leucémie. Des mutations préexistantes des cellules souches hématopoïétiques (CSH) pourraient être un mécanisme coopérant dans la leucémogenèse. Ces mutations impliquent principalement des modulateurs épigénétiques dans les cellules souches ou progénitrices hématopoïétiques, entraînant leur expansion clonale chez des individus sans maladie hématologique manifeste. Cette condition, nommée hématopoïèse clonale, représente un état pré-leucémique pouvant favoriser l'émergence de mutations capables de conduire la leucémogenèse. En effet, les mutations NPM1 s'associent fréquemment à des mutations coexistantes impliquant des gènes des voies de signalisation, de la méthylation de l'ADN, de l'épissage de l'ARN, du complexe cohésine, de la transcription génique et de la suppression tumorale.

Bien que quelques études aient montré que certaines mutations coexistantes affectent négativement le pronostic de la maladie, des controverses subsistent quant à leur impact réel. Par conséquent, le paysage mutationnel seul ne peut pleinement expliquer l'évolution clinique de certains patients dans ce groupe de leucémies à faible risque ; d'autres facteurs pourraient jouer un rôle dans l'hétérogénéité de ce sous-groupe de LAM. Récemment, des efforts majeurs ont été faits pour mieux comprendre la niche hématopoïétique leucémique, impliquée dans la réfractarité et la rechute de la maladie.

Les cellules souches hématopoïétiques régulent leurs processus de prolifération, différenciation et auto-renouvellement dans une niche spécifique de la moelle osseuse, via l'interaction avec le microenvironnement médullaire. Le microenvironnement possède un compartiment cellulaire constitué principalement de cellules souches mésenchymateuses (CSM), mais aussi d'ostéoblastes, de cellules endothéliales, de macrophages. En particulier, les sous-groupes de CSM ont des rôles différents dans la régulation de l'activité des CSH.

Les cellules souches leucémiques sont un petit sous-groupe de cellules leucémiques capables d'auto-renouvellement et possédant des propriétés de souche. Par définition, ces cellules peuvent ré-initier la leucémie si elles sont greffées chez un hôte receveur.

Le microenvironnement médullaire interagit également avec les cellules souches leucémiques (CSL), modifiant leur prolifération, propriétés d'adhésion, quiescence et expansion clonale.

Parallèlement, des études ont montré que les CSL peuvent reprogrammer les CSM et recevoir un soutien trophique, une protection contre le stress oxydatif et une préservation des agents chimiothérapeutiques toxiques, favorisant la formation d'une "niche leucémique". D'autre part, les CSM de la moelle osseuse interagissent avec les CSL, directement ou indirectement, et modifient la prolifération, les propriétés d'adhésion, la quiescence et l'expansion clonale des CSL. En conséquence, les CSM contribuent au maintien des CSL. Le remodelage des CSM est une stratégie d'auto-renouvellement de la leucémogenèse qui pourrait expliquer l'hétérogénéité clinique et pourrait ainsi être un facteur pronostique potentiel.

Plusieurs études ont révélé la présence d'altérations fonctionnelles au niveau des CSM médullaires chez les patients atteints de LAM, telles qu'une diminution de la prolifération, un taux apoptotique accru et un état pro-inflammatoire.

Bien que le microenvironnement médullaire semble jouer un rôle clé dans la promotion de la chimiorésistance dans la LAM, il reste incertain si ces altérations ou d'autres sont liées à la pathogenèse de la leucémie.

Les patients atteints de LAM présentent des caractéristiques altérées des CSM ; en particulier, il y a une quantité réduite de CSM primitives, définies comme CD146+/nestine+, comparées aux donneurs sains (DS). Les CSM médullaires nestine+ améliorent la survie des cellules leucémiques et la chimiorésistance en stimulant la phosphorylation oxydative et ainsi en augmentant la production d'énergie. Cette sous-population semble être associée à l'évolution de la maladie : les patients qui rechutent ont un pourcentage accru de CSM CD146+/nestine+ par rapport aux sujets en rémission.

De plus, les CSM modifiées interagissent différemment avec les CSH et les CSL, inhibant sélectivement l'hématopoïèse normale et favorisant respectivement la leucémogenèse et la chimiorésistance. Le mécanisme de protection stromale des cellules leucémiques est complexe et implique un réseau de cytokines, chimiokines, facteurs solubles et microvésicules (MV) qui favorisent la prolifération des CSL. Un mécanisme d'action probable est l'interaction entre les cellules stromales médullaires et les CSL via la libération de CXCL12 par les CSM et sa liaison au récepteur CXCR4 à la surface des CSL. Plus en détail, les cellules leucémiques exploitent l'axe CXCL12/CXCR4 pour se localiser dans une niche médullaire protectrice, habituellement réservée aux CSH normales. En conséquence, les CSL résident dans un environnement qui favorise leur survie et les protège de la chimiothérapie. Pour cette raison, l'axe CXCL12/CXCR4 pourrait être ciblé par de futures thérapies pour prévenir les rechutes.

À notre connaissance, il n'existe pas de données concernant la caractérisation du microenvironnement médullaire dans la LAM mutée NPM1. La caractérisation des CSM, en tant que composants les plus représentatifs du microenvironnement médullaire, pourrait être utile pour l'identification de mécanismes cellulaires spécifiques qui pourraient expliquer le taux élevé de rechute observé chez ces patients.

Objectifs de l'étude

Objectif général :

Caractériser les CSM médullaires des sujets atteints de LAM NPM1mut en tant que possibles nouveaux indicateurs de l'évolution clinique des patients.

En détail, seront étudiés le phénotype, le profil génétique et la fonction des CSM-AML, et évaluée leur activité paracrine afin de comprendre les mécanismes qui favorisent la résistance au traitement et la survenue de rechute dans la LAM NPM1mut au niveau du microenvironnement médullaire. L'activité paracrine des CSM sera évaluée par l'étude et la caractérisation des microvésicules libérées par les CSM après privation.

Objectif principal :

L'objectif principal de cette étude est la détection du pourcentage de CSM CD146+ au diagnostic, car cette sous-population semble être impliquée dans la création de la niche des CSL et la chimiorésistance. Il a été décrit que la moelle osseuse des patients en rechute montre un pourcentage plus élevé de cette sous-population de CSM comparé aux patients en rémission clinique. Le but est de démontrer que chez les patients LAM NPM1mut, il existe une différence statistiquement significative dans le pourcentage de CSM CD146+ (au diagnostic) comparé aux CSM-DS et CSM-DC (CSM de contrôle de maladie : patients LAM NPM1 wt).

Objectif co-principal :

Comparaison du pourcentage de cellules CD146+ au diagnostic et à différents temps (diagnostic, post-induction, fin de traitement, suivi, pré-greffe, rechute) entre les patients en rechute et les patients qui ne rechutent pas dans l'ensemble de la population (LAM NPM1mut et LAM-NPM1wt)

Objectifs secondaires :

1. Comparer la sous-population de CSM CD146+ chez les patients LAM NPM1mut et LAM NPM1wt à chaque temps prédéfini.

2. Caractériser les CSM-AML chez les patients avec LAM NPM1mut vs LAM NPM1wt. Suivant les directives internationales pour la définition des CSM (Dominici et al., 2006), seront évaluées la morphologie, la capacité à adhérer au plastique, l'efficacité clonogénique, la capacité proliférative et la transition vers la sénescence.

   L'expression des marqueurs de surface CD105, CD73 et CD90 et l'absence de CD45, CD34, CD14, CD19 et HLA-DR seront évaluées par marquage avec des anticorps monoclonaux et évaluation par cytométrie en flux multiparamétrique (MFC) (FacsCanto II, Becton Dickinson). L'expression de CD146 et nestine sera évaluée sur les échantillons obtenus à des temps spécifiques. La capacité des CSM-AML à se différencier en adipocytes et ostéocytes sera déterminée après stimulation "in vitro" avec les facteurs de différenciation appropriés.

3. Caractérisation fonctionnelle des CSM de patients LAM NPM1mut vs LAM NPM1wt. Les propriétés fonctionnelles des CSM seront évaluées par le développement d'une co-culture de CSM-AML en condition autologue (cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du patient/CSM du patient) et allogénique (PBMC de donneur sain/CSM du patient). Ensuite, seront évalués le potentiel immunomodulateur, la capacité à générer des sous-populations T, B et NK et la régulation de l'axe CXCR4/CXCL12. De plus, les cytokines pro-inflammatoires et régulatrices dans le surnageant de culture seront quantifiées.
4. Caractérisation génomique des CSM chez les patients avec LAM NPM1mut vs LAM-NPM1wt En utilisant le séquençage de nouvelle génération (NGS) avec l'aide d'un panel de gènes mutés récurrents dans les néoplasmes myéloïdes.

Objectif tertiaire exploratoire

• Tri de la sous-population de CSM CD146+/nestine+ pour de futures études de co-culture in vitro
• Isolement et caractérisation des MV libérées par les CSM-AML après privation.
• Développement de cultures de PBMC de DS avec des MV afin d'évaluer leur activité paracrine.

Conception de l'étude Il s'agit d'une étude pilote observationnelle prospective longitudinale in vitro monocentrique

Sujets et critères d'inclusion Patients adultes avec une Leucémie Aiguë Myéloïde de novo diagnostiquée à la Clinique Hématologique de la Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia.

Les contrôles sont des donneurs sains de cellules souches hématopoïétiques pour greffe de moelle osseuse recrutés par l'Oncohématologie Pédiatrique, après signature du consentement éclairé

Collecte des échantillons Expansion et analyse des CSM médullaires à des temps sélectionnés (diagnostic, fin d'induction, fin de consolidation, suivi, avant greffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT), rechute).

Aux mêmes temps, un échantillon de sang périphérique sera collecté. Chaque temps planifié représente une ponction de moelle osseuse et une collecte de sang de pratique clinique ordinaire.

Méthodes

Objectifs principal et co-principal :

Soixante patients avec une Leucémie Aiguë Myéloïde de novo diagnostiquée à la Clinique Hématologique de la Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo de Pavia seront recrutés sur trois ans ;

Objectif principal et co-principal :

Comme procédure standard, la ponction de moelle osseuse des patients recrutés sera collectée au diagnostic, fin d'induction, fin de consolidation, suivi, avant et après HSCT, rechute.

Les CSM seront isolées de la moelle osseuse des sujets LAM NPM1mut et LAM-NPM1wt, puis cultivées "in vitro" avec un milieu de culture DMEM+ lysé à 5 % jusqu'à sénescence.

L'expression des marqueurs de surface CD146 et nestine sera évaluée par marquage intracytoplasmique et analyse ultérieure par MFC FacsCanto II (BD). Le pourcentage de CSM CD146+/nestine+ au début de la maladie chez les patients LAM NPM1mut sera comparé au pourcentage des DS et contrôles de maladie.

Objectifs secondaires :

La caractérisation des CSM médullaires des patients par évaluation de l'efficacité clonogénique (unités formant colonies, CFU-f). Parallèlement, la capacité proliférative sera évaluée en termes de doublement cumulatif de population (cPD). La sénescence des CSM-AML sera définie comme le moment où le nombre de cellules récupérées est inférieur ou égal au nombre de cellules cultivées. Les cellules sénescentes seront détectées en utilisant la β-galactosidase.

La capacité des CSM-AML à se différencier en adipocytes et ostéocytes, induite par l'ajout de facteurs spécifiques in vitro : le colorant Rouge Alizarine colore spécifiquement les gouttelettes lipidiques, tandis que le colorant phosphatase alcaline mettra en évidence la présence de dépôts de calcium, typiques des ostéocytes.

Aux mêmes temps, un échantillon de sang périphérique sera collecté, un résidu des analyses diagnostiques standard effectuées pendant l'activité clinique. À partir de l'échantillon, les PBMC seront extraites et utilisées dans les expériences d'immunomodulation ultérieures.

Les propriétés fonctionnelles des CSM-AML seront évaluées après co-culture avec des PBMC. Après trois jours d'incubation, la capacité des CSM à moduler la prolifération des PBMC sera analysée par incorporation de Thymidine Titrée. Les résultats seront comparés à ceux obtenus avec les CSM-DS et contrôles de maladie.

Après dix jours d'incubation dans la même culture, la capacité des CSM-AML à réguler le pourcentage des sous-populations lymphocytaires (lymphocytes T et B et cellules NK) par MFC sera évaluée, ainsi que le pourcentage de cellules T régulatrices par mesure intracytoplasmique de Foxp3, et l'expression de CXCR4 à la surface des lymphocytes des patients. Les surnageants de culture seront stockés et utilisés pour doser CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2 par ELISA.

L'ADN extrait des CSM des sujets LAM NPM1mut et LAM NPM1wt sera analysé par un panel personnalisé TruSight Myeloid Sequencing Panel de 54 gènes séquencés par Illumina MiSeq, avec l'ADN extrait des blastes leucémiques des mêmes patients.

Objectif tertiaire exploratoire Si le pourcentage de CSM CD146+/nestine+ est adéquat, cette sous-population sera triée et les analyses mentionnées ci-dessus seront effectuées dessus.

Les MV seront isolées par ultracentrifugation et quantifiées (NanoSight). L'expression des marqueurs de surface des MV sera évaluée par le kit MACSPlex Exosomes (Miltenyi) et le cytomètre en flux MacsQuant (Miltenyi).

Le contenu protéique des MV sera évalué par HPLC et spectrométrie de masse.

Des expériences de co-culture en présence de MV seront développées.

Collecte des données Les données seront enregistrées dans une base de données électronique. Les patients recevront un code d'identification garantissant leur confidentialité. Le chercheur principal gardera séparément une liste avec les données d'identification des patients et le code correspondant.

Calcul de la taille d'échantillon Quatre-vingt-dix sujets seront recrutés (60 patients : 30 LAM NPM1mut, 30 LAM NPM1wt et 30 CSM-DS). Avec cette taille d'échantillon, il sera possible de détecter une comparaison post-hoc 2x2 significative (erreur de type I bilatérale alpha=0,017) dans les niveaux de CSM nestine+/CD146+ après analyse de variance à un facteur si la différence entre les moyennes est de 85 % de l'écart-type commun. Une puissance de 80 % a été considérée.

Analyse statistique Les variables qualitatives seront décrites comme fréquences absolues et relatives de chaque catégorie. Les variables quantitatives seront résumées comme moyenne±écart-type, ou par médiane et intervalle interquartile. Si nécessaire, des transformations logarithmiques des données seront adoptées.

Les analyses statistiques seront réalisées avec Stata 17 (StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)

Analyse statistique pour le critère de jugement principal Les niveaux de CSM nestine+/CD146+ au départ seront comparés entre trois groupes par analyse de variance à un facteur, suivie de comparaisons post-hoc 2x2 de Bonferroni.

Analyse statistique pour le critère de jugement co-principal L'association entre les niveaux de CSM nestine+/CD146+ à différents temps et la rechute sera évaluée par un modèle conjoint de données longitudinales et de survie.

Analyse statistique pour les critères de jugement secondaires

1. La comparaison selon le statut mutationnel NPM1 sera réalisée en ajustant des modèles linéaires ou logistiques mixtes multiniveaux (avec les patients traités comme effet aléatoire).
2. Les interactions entre les CSM et les cellules leucémiques seront analysées en ajustant des modèles linéaires ou logistiques mixtes multiniveaux (avec les patients traités comme effet aléatoire).
3. Le test exact de Fisher sera effectué pour comparer les patients LAM NPM1mut vs LAM-NPM1wt.

Analyse statistique pour les critères de jugement tertiaires exploratoires Pour les critères de jugement tertiaires exploratoires, des statistiques descriptives seront employées.

Consentement éclairé Chaque patient recevra le matériel d'information de l'étude et un formulaire de consentement éclairé signé sera obtenu.

Une notice d'information et le consentement éclairé préciseront que le patient ne sera pas soumis à des prélèvements sanguins et des ponctions de moelle osseuse supplémentaires.