NPM1 돌연변이 저위험 급성 골수성 백혈병에서의 중간염 줄기세포: 종양 미세환경 연구 및 그 결과에 대한 기여

배경 급성 골수성 백혈병(AML)은 골수 전구세포의 클론성 증식 및 분화 정지를 특징으로 하는 이질성 혈액학적 악성 종양입니다.

불완전하지만, AML 병인에 대한 현재 지식은 환자를 다른 예후군으로 계층화하고 맞춤형 치료 전략의 출현을 가능하게 했습니다.

유럽 백혈병 네트워크(ELN)는 유전자 돌연변이 및 염색체 이상에 따라 신환 AML을 유리, 중간 및 불량 위험군으로 계층화합니다. 특히, 유리 위험 프로필을 가진 환자는 핵심 결합 인자 재배열(CBF)의 존재, 핵인산 단백질 1(NPM1) 돌연변이 및 fms 관련 수용체 티로신 키나제 3(FLT3) 야생형을 가진 정상 핵형, 낮은 대립유전자 비율을 가진 NPM1 돌연변이 및 FLT3-내부 탠덤 중복, 또는 CCAAT/증강자 결합 단백질 α(CEBPα)의 이중 대립유전자 돌연변이로 특징지어집니다.

유리 위험 프로필에도 불구하고, 전통적 화학요법 후 장기 추적 관찰 중인 환자에서 재발률은 NPM1 돌연변이 AML에서 최대 50%, CBF AML에서 40%, CEBPα 이중 대립유전자 돌연변이 AML에서 44%에 이릅니다. 이 데이터는 유리 위험 AML에서 병인 및 내성 기전에 대한 더 많은 지식을 얻기 위한 추가 연구의 필요성을 강조하며, 이로써 환자 계층화를 개선할 수 있습니다. 또한, 이러한 통찰은 새로운 치료 표적의 발견으로 이어질 수 있습니다.

NPM1은 AML에서 가장 흔한 돌연변이로, 신환 세포유전학적 정상 AML의 약 50-60%를 차지합니다. 쥐 및 생체 내 연구는 NPM1 돌연변이가 백혈병 생성 및 골수 증식을 촉진하지만 백혈병을 유발하기에는 충분하지 않음을 보여주었습니다. 조혈모세포(HSC)의 기존 돌연변이는 백혈병 생성에 협력할 수 있는 가능한 기전일 수 있습니다. 이러한 돌연변이는 주로 조혈모 또는 전구세포에서 후성유전학적 조절인자를 포함하여, 명백한 혈액학적 질병이 없는 개인에서 클론성 증식을 초래합니다. 이 상태는 클론성 조혈작용으로 명명되며, 백혈병 생성으로 이끌 수 있는 돌연변이의 출현을 촉진할 수 있는 전백혈병 상태를 나타냅니다. 실제로, NPM1 돌연변이는 신호 전달 경로, DNA 메틸화, RNA 접합, 코헤신 복합체, 유전자 전사 및 종양 억제 유전자를 포함하는 동반 돌연변이와 자주 함께 나타납니다.

일부 동반 돌연변이가 질병 예후에 부정적 영향을 미친다는 몇몇 연구가 있지만, 그들의 실제 영향에 대해서는 여전히 논쟁이 남아 있습니다. 따라서, 돌연변이 경관만으로는 이 저위험 백혈병군의 일부 환자들의 임상 경과를 완전히 설명할 수 없습니다; 다른 요인들이 이 AML 하위군의 이질성에 역할을 할 수 있습니다. 최근, 질병 내성 및 재발과 관련된 백혈병성 조혈 틈새에 대한 통찰력을 얻기 위한 주요 노력이 이루어졌습니다.

조혈모세포는 골수 미세환경과의 상호작용을 통해 특정 골수 틈새에서 증식, 분화 및 자기재생 과정을 조절합니다. 미세환경은 주로 중간염 줄기세포(MSC)로 구성되지만, 또한 조골세포, 내피세포, 대식세포로 이루어진 세포 구획을 가지고 있습니다. 특히, MSC 하위군은 HSC 활성 조절에서 다른 역할을 가집니다.

백혈병 줄기세포는 자기재생 능력과 줄기세포 특성을 가진 백혈병 세포의 작은 하위군입니다. 정의상, 이러한 세포들은 수용체 숙주에 이식되면 백혈병을 다시 시작할 수 있습니다.

골수 미세환경은 또한 백혈병 줄기세포(LSC)와 상호작용하여 그들의 증식, 접착 특성, 정지 상태 및 클론성 증식을 변경합니다.

동시에, 연구들은 LSC가 MSC를 재프로그래밍하고 영양 지원, 산화 스트레스로부터의 보호 및 독성 화학요법제로부터의 보존을 받아 "백혈병 틈새"의 형성을 촉진할 수 있음을 보여주었습니다. 반면에, 골수 MSC는 LSC와 직접 또는 간접적으로 상호작용하고 LSC의 증식, 접착 특성, 정지 상태 및 클론성 증식을 변경합니다. 결과적으로, MSC는 LSC 유지에 기여합니다. MSC 재구성은 임상적 이질성을 설명할 수 있는 백혈병 생성 자기재생 전략으로, 잠재적 예후 인자가 될 수 있습니다.

여러 연구들은 AML 환자에서 BM-MSC 수준에서 기능적 변화의 존재를 밝혀냈는데, 이는 감소된 증식, 증가된 세포사멸률 및 염증 촉진 상태를 포함합니다.

골수 미세환경이 AML에서 화학요법 내성 촉진에 중요한 역할을 하는 것으로 보이지만, 이러한 변화나 다른 변화들이 백혈병 병인과 관련이 있는지 여부는 여전히 불분명합니다.

AML 환자는 변화된 MSC 특성을 가지고 있습니다; 특히, 건강한 기증자(HD)와 비교하여 원시적 MSC(CD146+/네스틴+로 정의됨)의 양이 감소합니다. 네스틴+ BM-MSC는 산화적 인산화를 자극하여 에너지 생산을 증가시킴으로써 백혈병 세포 생존 및 화학요법 내성을 강화합니다. 이 하위군은 질병 경과와 관련이 있는 것으로 보입니다: 재발한 환자는 관해 상태의 대상자에 비해 CD146+/네스틴+ MSC의 비율이 증가합니다.

또한, 변형된 MSC는 HSC와 LSC와 다르게 상호작용하여 각각 정상 조혈작용을 선택적으로 억제하고 백혈병 생성 및 화학요법 내성을 촉진합니다. 백혈병 세포에 대한 간질 매개 보호 기전은 복잡하며, LSC 증식을 촉진하는 사이토카인, 케모카인, 가용성 인자 및 미소포(MV)의 네트워크를 포함합니다. 작용 기전의 가능성은 BM 간질세포와 LSC 사이의 상호작용으로, MSC에 의한 CXCL12 방출 및 LSC 표면의 CXCR4 수용체와의 결합을 통해 이루어집니다. 더 자세히 말하면, 백혈병 세포는 정상 HSC에만 제한되는 보호적 골수 틈새로의 귀환을 위해 CXCL12/CXCR4 축을 이용합니다. 결과적으로, LSC는 그들의 생존을 촉진하고 화학요법으로부터 보호하는 환경에 거주합니다. 이러한 이유로 CXCL12/CXCR4 축은 재발을 예방하기 위한 미래 치료의 표적이 될 수 있습니다.

우리가 아는 한, NPM1 돌연변이 AML에서 골수 미세환경의 특성화에 관한 데이터는 없습니다. 골수 미세환경의 가장 대표적인 구성요소로서의 MSC 특성화는 이러한 환자에서 관찰되는 높은 재발률을 설명할 수 있는 특정 세포 기전의 식별에 유용할 수 있습니다.

연구 목적

일반 목적:

환자 임상 결과의 가능한 새로운 지표로서 NPM1 돌연변이 AML 환자의 BM-MSC를 특성화합니다.

자세히 말하면, 골수 미세환경 수준에서 NPM1 돌연변이 AML에서 치료 내성 및 재발 발생을 촉진하는 기전을 이해하기 위해 AML-MSC의 표현형, 유전자 프로필 및 기능을 연구하고, 그들의 파라크린 활동을 평가할 것입니다. MSC의 파라크린 활동은 박탈 후 MSC에 의해 방출된 미소포의 연구 및 특성화를 통해 평가될 것입니다.

주요 목적:

이 연구의 주요 목적은 이 하위군이 LSC 틈새 형성 및 화학요법 내성에 관여하는 것으로 보이기 때문에 진단 시 CD146+ MSC 비율의 검출입니다. 재발 환자의 골수는 임상 관해를 겪는 환자에 비해 이 MSC 하위군의 더 높은 비율을 보이는 것으로 기술되었습니다. 목표는 NPM1 돌연변이 AML 환자에서 HD-MSC 및 DC-MSC(질병 대조 MSC: NPM1 야생형 AML 환자)와 비교하여 진단 시 CD146+ MSC 비율에 통계적으로 유의한 차이가 있음을 입증하는 것입니다.

공동 주요 목적:

전체 인구(NPM1 돌연변이 AML 및 NPM1 야생형 AML)에서 재발 환자와 재발하지 않는 환자 사이의 진단 시 및 다른 시점(진단, 유도 후, 치료 종료, 추적 관찰, 이식 전, 재발)에서 CD146+ 세포 비율 비교

부차적 목적:

1. 미리 정의된 각 시점에서 NPM1 돌연변이 AML 및 NPM1 야생형 AML 환자의 MSC CD146+ 하위군 비교

2. NPM1 돌연변이 AML 대 NPM1 야생형 AML 환자의 AML-MSC 특성화. MSC 정의를 위한 국제 지침(Dominici 외, 2006)에 따라 형태, 플라스틱 접착 능력, 클론 형성 효율, 증식 능력 및 노화로의 전이를 평가할 것입니다. 표면 마커 CD105, CD73 및 CD90의 발현 및 CD45, CD34, CD14, CD19 및 HLA-DR의 부재는 단일클론 항체로 표지하고 다중 매개 변수 유세포 분석(MFC)(FacsCanto II, Becton Dickinson)을 통해 평가할 것입니다. CD146 및 네스틴 발현은 특정 시점에서 얻은 샘플에서 평가될 것입니다. AML-MSC의 지방세포 및 골세포로 분화하는 능력은 적절한 분화 인자로 "in vitro" 자극 후 결정될 것입니다.

3. NPM1 돌연변이 AML 대 NPM1 야생형 AML 환자의 MSC 기능적 특성화. MSC의 기능적 특성은 자가 설정(환자의 말초혈액 단핵세포(PBMC)/환자의 MSC) 및 동종 이종 설정(건강한 기증자의 PBMC/환자의 MSC)에서 AML-MSC의 공동 배양 개발을 통해 평가될 것입니다. 그런 다음 면역 조절 잠재력, T, B 및 NK 하위군 생성 능력 및 CXCR4/CXCL12 축 조절을 평가할 것입니다. 또한, 배양 상층액의 염증 촉진 및 조절 사이토카인을 정량화할 것입니다.
4. 골수성 신생물에서 빈번하게 돌연변이되는 유전자 패널의 도움으로 차세대 염기서열 분석(NGS)을 사용하여 NPM1 돌연변이 AML 대 NPM1 야생형 AML 환자의 MSC 유전체 특성화

3차 탐색적 목적

• 향후 in vitro 연구를 위한 공동 배양을 위해 CD146+/네스틴+ MSC 하위군의 분리
• 박탈 후 AML-MSC에 의해 방출된 MV의 분리 및 특성화
• 그들의 파라크린 활동을 평가하기 위해 HD의 PBMC와 MV를 사용한 배양 개발

연구 설계 이는 파일럿 단일 기관 전향적 관찰, 종단적, in vitro 연구입니다

대상 및 포함 기준 파비아의 Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo의 Clinica Ematologica에서 진단된 신환 급성 골수성 백혈병 성인 환자.

대조군은 정보 제공 동의서 서명 후 Oncoematologia Pediatrica에 의해 등록된 골수 이식을 위한 조혈모세포 건강한 기증자입니다

샘플 수집 선택된 시점(진단, 유도 종료, 공고 요법 종료, 추적 관찰, 조혈모세포 이식(HSCT) 전, 재발)에서 골수 MSC의 확장 및 분석.

동일한 시점에서 말초혈액 샘플이 수집될 것입니다. 계획된 각 시점은 일반적인 임상 실습 골수 흡인 및 혈액 수집을 나타냅니다.

방법

주요 및 공동 주요 목적:

파비아의 Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo의 Clinica Ematologica에서 진단된 신환 급성 골수성 백혈병 60명의 환자가 3년 동안 등록될 것입니다;

주요 및 공동 주요 목적:

표준 절차로서, 등록 환자의 골수 흡인은 진단, 유도 종료, 공고 요법 종료, 추적 관찰, HSCT 전후, 재발 시 수집될 것입니다.

MSC는 NPM1 돌연변이 및 NPM1 야생형 AML 대상자의 골수에서 분리된 후, 노화까지 5% 용혈 DMEM+ 배양 배지로 "in vitro" 배양될 것입니다.

표면 마커 CD146 및 네스틴의 발현은 세포질 내 표지 및 MFC FacsCanto II(BD)를 통한 후속 분석을 통해 평가될 것입니다. NPM1 돌연변이 AML 환자의 질병 발병 시 CD146+/네스틴+ MSC 비율을 HD 및 질병 대조군의 비율과 비교할 것입니다.

부차적 목적:

클론 형성 효율(집락 형성 단위, CFU-f)을 평가하여 환자의 BM-MSC 특성화. 한편, 증식 능력은 누적 인구 배가(cPD) 측면에서 평가될 것입니다. AML-MSC의 노화는 회수된 세포 수가 배양된 세포 수보다 적거나 같은 때로 정의될 것입니다. 노화 세포는 β-갈락토시다제를 사용하여 검출될 것입니다.

특정 인자를 in vitro에서 첨가함으로써 유도된 AML-MSC의 지방세포 및 골세포로 분화하는 능력: 알리자린 레드 염료는 지방 방울을 특이적으로 염색하는 반면, 알칼리성 인산가수분해효소 염료는 골세포의 전형적인 칼슘 침착물의 존재를 강조할 것입니다.

동일한 시점에서, 말초혈액 샘플이 수집될 것이며, 이는 임상 활동 중 수행된 표준 진단 분석의 잔여물입니다. 샘플에서 PBMC가 추출되어 후속 면역 조절 실험에 사용될 것입니다.

AML-MSC의 기능적 특성은 PBMC와의 공동 배양 후 평가될 것입니다. 3일간의 배양 후, MFC를 통해 PBMC 증식 조절 능력을 분석할 것입니다. 결과는 HD-MSC 및 질병 대조군에서 얻은 결과와 비교될 것입니다.

동일한 배양에서 10일간의 배양 후, AML-MSC의 림프구 하위군(T 및 B 림프구 및 NK 세포) 비율 조절 능력이 MFC를 통해 평가될 것이며, 세포질 내 Foxp3 측정을 통한 조절 T 세포 비율 및 환자 림프구 표면의 CXCR4 발현도 평가될 것입니다. 배양 상층액은 저장되어 ELISA를 통해 CXCL12, IL-6, IFN-γ, IL-10, PGE-2를 정량화하는 데 사용될 것입니다.

NPM1 돌연변이 및 NPM1 야생형 AML 대상자의 MSC에서 추출된 DNA는 Illumina MiSeq로 염기서열 분석된 54개 유전자의 맞춤형 TruSight Myeloid Sequencing Panel을 통해 분석될 것이며, 동일한 환자의 백혈병 모세포에서 추출된 DNA와 함께 분석될 것입니다.

3차 탐색적 목적 CD146+/네스틴+ MSC 비율이 적합하다면, 이 하위군이 분리되고 위에서 언급한 분석이 수행될 것입니다.

MV는 초원심분리를 통해 분리되고 정량화될 것입니다(NanoSight). MV 표면 마커의 발현은 MACSPlex Exosomes Kit(Miltenyi) 및 MacsQuant Flow Cytometer(Miltenyi)를 통해 평가될 것입니다.

MV의 단백질 함량은 HPLC 및 질량 분석법을 통해 평가될 것입니다.

MV 존재 하에서의 공동 배양 실험이 개발될 것입니다.

데이터 수집 데이터는 전자 데이터베이스에 기록될 것입니다. 환자는 그들의 개인정보를 보장하는 식별 코드를 받을 것입니다. 주 연구자는 환자의 식별 데이터와 해당 코드를 별도로 보관할 것입니다.

표본 크기 계산 90명의 대상자가 등록될 것입니다(60명의 환자: 30명 NPM1 돌연변이 AML, 30명 NPM1 야생형 AML 및 30명 HD-MSC). 이 표본 크기로 일원 분산 분석 후 2x2 사후 비교(양측 제1종 오류 알파=0.017)를 통해 평균 간 차이가 공통 표준 편차의 85%인 경우 네스틴+/CD146+ MSC 수준에서 유의한 차이를 검출할 수 있습니다. 80%의 검정력이 고려되었습니다.

통계 분석 질적 변수는 각 범주의 절대 및 상대 빈도로 기술될 것입니다. 양적 변수는 평균±표준 편차 또는 중앙값 및 사분위수 범위로 요약될 것입니다. 필요한 경우, 데이터의 로그 변환이 채택될 것입니다.

통계 분석은 Stata 17(StataCorp. 2021. Stata Statistical Software: Release 17. College Station, TX: StataCorp LLC.)을 사용하여 수행될 것입니다.

주요 종점에 대한 통계 분석 기준선에서의 네스틴+/CD146+ MSC 수준은 세 그룹 간에 일원 분산 분석으로 비교된 후 Bonferroni의 2x2 사후 비교가 수행될 것입니다.

공동 주요 종점에 대한 통계 분석 다른 시점에서의 네스틴+/CD146+ MSC 수준과 재발 사이의 연관성은 종단 및 생존 데이터의 결합 모델로 평가될 것입니다.

부차적 종점에 대한 통계 분석

1. NPM1 돌연변이 상태에 따른 비교는 다수준 혼합(환자를 무작위 효과로 처리) 선형 또는 로지스틱 모델을 적합시켜 수행될 것입니다.
2. MSC와 백혈병 세포 사이의 상호작용은 다수준 혼합(환자를 무작위 효과로 처리) 선형 또는 로지스틱 모델을 적합시켜 분석될 것입니다.
3. NPM1 돌연변이 AML 대 NPM1 야생형 AML 환자를 비교하기 위해 Fisher의 정확 검정이 수행될 것입니다.

3차 탐색적 종점에 대한 통계 분석 3차 탐색적 종점에 대해서는 기술 통계가 사용될 것입니다.

정보 제공 동의 각 환자는 연구 정보 자료를 받고 서명된 정보 제공 동의서가 얻어질 것입니다.

정보 안내서 및 정보 제공 동의서는 환자가 추가적인 채혈 및 골수 흡인을 받지 않을 것임을 명확히 할 것입니다.