TM 및 TI 환자의 골다공증 치료를 위한 Neridronate(Nerixia®)의 효능 및 안전성 (Nerixia)

연구의 목적 현재, 글로벌 치료 접근 방식으로 인해 지중해 빈혈 및 중증 지중해 빈혈 중간의 예후는 제한이 없습니다. 여러 저자에 따르면 높은 비율의 환자가 골감소증-골다공증을 앓고 있음에도 불구하고 어린 시절의 정기적인 수혈 요법과 초기 철 킬레이트 요법은 과거에 이 질병의 특징이었던 뼈 기형을 예방합니다. 이 지속적인 합병증은 빈혈, 유전적 요인, 뼈 대사에 관여하는 성 호르몬, 철 및 킬레이트 요법, 갑상선기능저하증, 혈청 비타민 D의 낮거나 정상 이하의 농도 등과 같은 하나 이상의 공존 요인에 의해 설명될 수 있습니다.

통증은 Center of Genoa에서 수행된 삶의 질에 대한 조사를 통해 같은 나이의 건강한 환자와 지중해 빈혈 환자를 구별하기 위해 고려할 수 있는 유일한 매개 변수로 나타났습니다. 더 자주 통증은 요추에 국한되며 종종 잘못된 그림으로 설명되며 척추체의 골다공증을 참조해야 합니다.

이러한 병리를 치료하는 전문 센터에서 관찰되는 자발 골절의 발생률이 증가하고 있습니다.

Thalassemia Intermedia는 경증에서 중증에 이르는 광범위한 표현형을 포함하는 외계 임상 개체입니다. 경미한 형태의 헤모글로빈 수치는 8-9g/dl 사이이며, 간헐적인 에피소드가 빈혈을 악화시키지 않는 한 정기적인 수혈 요법이 필요하지 않고 안정적입니다. 골수의 확장은 관찰되지 않습니다. 대조적으로, 현저한 비효율적 적혈구 생성과 함께 빈혈이 지속적으로 더 심각한 형태(6.5-7.5g/dl)가 있습니다. 이러한 경우 특히 소아기에 진단이 내려지면 환자는 골다공증과 같은 유사한 합병증이 있는 주요 형태와 유사한 수혈 요법을 받아야 합니다.

이러한 이유로 중증 지중해 빈혈 및 지중해 빈혈에 걸린 환자의 경우 삶의 질과 기대 수명을 모두 개선하기 위해 골다공증의 주요 예방 및 조기 진단은 물론 확립된 질병의 치료가 중요합니다.

이전에 기술된 치료 시험에서 비스포스포네이트는 골 재흡수를 억제하는 능력과 골밀도를 증가시키는 부작용이 상대적으로 적기 때문에 효과적인 것으로 나타났습니다. 이전의 모든 임상시험은 소수의 환자를 대상으로 수행되었으므로 Neridronate의 효능을 테스트하기 위해 무작위 공개 라벨 대규모 다심 임상시험을 제안합니다. 이 약물을 90일마다 정맥 주사할 수 있으므로 투여 요법이 간단해지고 투여 빈도가 줄어듭니다. 이는 이미 일일 치료 부하가 높은 환자의 치료 순응도를 향상시키는 중요한 요소입니다.

1차 목적 이 연구의 1차 목적은 측정된 골밀도(BMD)를 증가시키기 위한 Neridronate(여러 임상 시험에서 파골 세포 매개 골 재흡수를 억제하는 능력이 있는 것으로 입증된 3세대 아미노비스포스포네이트)의 효능을 평가하는 것입니다. 이중 X선 농도계(DXA)를 통해 Bone densitometry는 기초 스크리닝과 치료 시작 후 6, 12, 18, 24개월에 시행됩니다.

2차 목표 골 전환에 대한 네리드로네이트의 효과는 선별 시 그리고 그 후 6, 12, 18, 24개월에 뼈 알칼리성 포스파타제(BALP) 및 유형 1 세릭 콜라겐(CTX-s)의 텔로펩티드 C-말단을 통해 평가됩니다. 치료의 시작.

마커의 복용량은 중앙 집중화됩니다. 연구 설계 지중해 빈혈 및 중증 지중해 빈혈 중간 환자의 골다공증 치료에서 Neridronate의 효능과 안전성을 평가하는 이탈리아 다중심 무작위 공개 라벨 치료 시험.

약물의 효능 및 안전성은 방문할 때마다 다음 매개변수를 측정하여 평가됩니다.

• 혈액학적: 헤모크롬
• 혈액 화학: 크레아티닌, BUN, AST, ALT, Ca, P, 단백질 전기영동, 총 단백질.

이소성 석회화 및 탄력가성황색종(PXE) 유사 증후군의 유병률과 추적 관찰은 연구 시작 시점과 24개월 후 신체 검사, 복부 초음파 검사 및 안저 검사를 통해 평가됩니다.

시험 기간 동안 골다공증에 대한 다른 알려진 위험 요소가 기록될 것입니다. 여기에는 골절의 유병률 및 발생률, 실행되는 경우 다형성 COLIA1 연구 시작 시 및 12개월 및 24개월에 뼈 기형의 존재 평가를 위한 형태 측정 DXA가 포함됩니다. 또한 QOL 및 증상 통증에 관한 데이터는 척도 SF-36의 투여를 통해 평가될 것입니다.

시험 기간 동안 모든 부작용이 기록됩니다.

확장 연구:

확장 연구의 목표

1. 간엽 줄기 세포 성장 및 골 형성 분화에 대한 철 과부하 및 킬레이트 분자의 영향에 대한 시험관 내 분석
2. 정상 및 지중해성 MSC의 증식 및 분화에 대한 네리드로네이트의 효과 평가.
3. 네리드로네이트를 사용하거나 사용하지 않고 치료한 지중해성 빈혈 환자로부터 제조된 MSC의 표현형 특성 규명 연구 설계 A. 중간엽 줄기세포 성장 및 골형성 분화에 대한 철 과부하 및 킬레이트 분자의 영향에 대한 시험관 내 분석 B. 정상 및 지중해성 MSC 증식에 대한 네리드로네이트의 효과 평가 그리고 차별화.

C. 네리드로네이트를 사용하거나 사용하지 않고 치료받은 지중해성 빈혈 환자로부터 제조된 중간엽 줄기세포의 표현형 특성 규명 A. 중간엽 줄기세포 성장 및 골형성 분화에 대한 철 과부하 및 킬레이트 분자의 영향에 대한 시험관 내 분석

1. 정상 피험자로부터 골수 간엽 줄기 세포 수집 준비 MSC를 분리하고 준비하기 위해 Oliva et. 알. (몰렉. 그리고 세포. Biochem., 2003, 247:55-60). MSC 준비에 대한 자세한 내용은 부록에 보고되어 있습니다.

   세포는 CD13, CD29, CD44, CD105, CD166과 같은 특정 표면 마커를 발현하고 조혈 세포 마커 CD14, CD34 및 CD45에 대해 음성이었습니다.

   이런 식으로 우리는 실험을 수행하는 정상적인 MSCs'bank를 준비하고 있습니다. 현재 우리는 이미 정상 피험자로부터 10개 이상의 중간엽 줄기세포 준비를 사용할 수 있습니다.

2. 중간엽 줄기세포의 증식 및 분화에 대한 철 과부하의 영향 분석 지중해성 빈혈 피험자가 철 과부하를 겪는다는 것은 잘 알려져 있지만 이 금속이 중간엽 줄기세포의 증식 및 분화에 미치는 영향에 대한 문헌 데이터는 없습니다. 이를 위해 아래와 같이 진행할 예정입니다. 우리는 증가하는 철 농도와 함께 배양된 대수 단계에서 MSC의 증식 속도와 철 및 페리틴 세포내 수준을 평가할 것입니다. 이는 생리적 혈액량, 즉 2-18 microg/ml에서 시작하여 발생하는 것과 유사하게 10배 더 높은 값에 도달할 때까지입니다. 지중해 빈혈 환자에서. 직접 세포 수, MTT 활력 분석 및 3H-티미딘 결합(DNA 합성)을 통해 성장 속도에 미치는 영향을 분석할 것입니다.

   계속해서 우리는 보고된 프로토콜에 따라 MSC의 주요 단백질 제품, 즉 유형 I 콜라겐의 수준에 대한 철 과부하의 영향을 분석할 것입니다. 처리되지 않고 철 과부하로 처리된 중간엽 줄기세포의 초기 계대(0-3)의 융합 배양물을 트립신화하고, 계수하고, 800xg에서 원심분리합니다. 펠릿은 250 microg/ml 펩신을 포함하는 0.5 M 아세트산에 재현탁됩니다.

   4°C에서 16시간 동안 부드럽게 진탕한 후, 불용성 잔류물을 20.000xg에서 1시간 동안 펠릿화하고 실행 완충액에 용해시키고 6% SDS-PAGE로 분석합니다. 그 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막에 블롯팅하고 인간 I형 콜라겐에 특이적인 토끼 단일클론 항체와 함께 배양합니다. 그런 다음 면역반응성 밴드를 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체와 함께 배양하고 향상된 화학발광 기술(ECL)로 검출합니다.

   분화에 대한 효과는 골아세포 표현형의 특정 마커, 즉 알칼리 포스파타제 활성 및 오스테오칼신 생산의 발현을 분석하여 평가될 것입니다. 또한, 우리는 세포외기질 무기질화에 의해 발현되는 중간엽 줄기세포의 골형성 능력을 평가할 것입니다. 컨플루언트 배양물을 덱사메타손 100nM 및 베타-글리세로포스페이트 10mM으로 구성된 골형성 배지와 함께 배양합니다. 골형성 능력이 있는 경우 2-4주 이내에 석회화 결절이 나타납니다. 매트릭스 광물화를 추가로 확인하기 위해 칼슘 수치를 측정하고 마지막으로 von Kossa 방법으로 특정 염색을 수행합니다.

3. 철 킬레이트 분자가 중간엽 줄기세포의 증식과 분화에 미치는 영향 분석 우리는 잘 알려진 단점과 독성에도 불구하고 지금까지 지중해 빈혈 치료에 가장 많이 사용된 킬레이트 분자인 DFO의 효과를 평가할 것입니다. 처리되지 않았거나 철 과부하로 처리된 중간엽 줄기세포 배양물은 탈라세믹 환자에게 약물을 투여한 후 생체 내에서 얻은 것과 유사한 농도로 DFO를 첨가할 것입니다. 성장 속도, 콜라겐 유형 I 수준, 알칼리성 포스파타제 활성, 오스테오칼신 생산 및 골 형성 능력에 대한 치료 효과를 분석할 것입니다.
4. 철 과부하 및/또는 DFO에 노출된 MSC에서 세포 주기 구성요소의 특성화 세포 주기 구성요소의 특성화가 증식 및 분화 과정의 중추적 사건을 이해하기 위한 기초를 나타낸다는 것은 잘 알려져 있습니다.

따라서, 상기 기술된 바와 같이 처리된 두 MSC 세포 집단으로부터 얻은 세포 추출물(즉, 철, DFO 또는 철 과부하 및/또는 데스페리옥사민)은 여러 사이클 단백질 성분에 대한 항체를 사용하는 면역블롯팅에 의해 분석될 것입니다. 특히 사이클린 D1, D2 및 D3, 사이클린 E, 사이클린 A; CDK4, CDK6, CDK2 및 CDK1; p16, p14, p15, p21 및 p27. 또한 망막모세포종 단백질의 인산화와 cdk 활성을 분석한다.

B. 정상 및 지중해성 MSC의 증식 및 분화에 대한 네리드로네이트의 효과 평가.

이 연구의 목적은 정상 및 지중해성 인간 중간엽 줄기세포에 대한 네리드로네이트의 효과를 시험관 내에서 분석하는 것입니다. 특히, 우리는 10(-4) M과 10(-6) M 사이의 농도에서 테스트된 약물이 치료 용량인 10(-5) M인 경우 MSC의 생존력, 증식 및 세포 활동에 영향을 미치는지 평가할 것입니다. 증식에 대한 효과는 3H-티미딘 혼입, MTT 테스트 및 세포 주기 엔진 조정의 측면에서 평가될 것입니다. 분화에 대한 작용은 특정 마커, 즉 유형 I 콜라겐 수준, 알칼리 포스파타제 활성 및 오스테오칼신 생산의 발현을 분석하여 평가될 것입니다. 또한 세포외기질 무기질화, 칼슘 수치 측정 및 von Kossa 염색을 통해 중간엽 줄기세포의 골형성 능력을 평가할 것입니다.

C. 네리드로네이트를 사용하거나 사용하지 않고 치료한 지중해성 빈혈 환자로부터 제조된 중간엽 줄기세포의 표현형 특성화 본 연구의 목적은 네리드로네이트를 사용한 지중해성 빈혈 환자의 치료가 골다공증 상태에 긍정적인 영향을 미치고 동시에 골형성 능력을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하는 것입니다. MSC. 따라서 우리는 네리드로네이트 치료 여부에 관계없이 지중해성 빈혈 환자로부터 중간엽 줄기세포를 준비하고 표준 방법에 따라 배양할 것입니다. 특히 성장 속도, 세포 주기 기계, 콜라겐 수준, AP 활동 및 오스테오칼신 합성을 분석할 것입니다. 가장 중요한 것은 세포외 매트릭스 광물화를 평가할 것입니다.