Účinnost a bezpečnost neridronátu (Nerixia®) k léčbě osteoporózy u pacientů s TM a TI (Nerixia)

Cíl studie Vzhledem ke globálnímu terapeutickému přístupu je v současnosti prognóza Thalassemia Major a Těžké Thalassemia Intermedia otevřená. Pravidelné transfuzní režimy od dětství a časná chelatační terapie železa předcházejí kostním deformitám, které v minulosti toto onemocnění charakterizovaly, i když podle některých autorů vysoké procento pacientů trpí osteopenií-osteoporózou. Tato přetrvávající komplikace může být vysvětlena jedním nebo více souběžnými faktory, jako je anémie, genetické faktory, pohlavní hormony zapojené do kostního metabolismu, železná a chelatační terapie, hypotyreóza, nízké nebo subnormální koncentrace sérového vitaminu D atd.

Bolest se ukázala být jediným parametrem, který lze považovat za rozlišující pacienty s Thalassemia Major od zdravých pacientů stejného věku prostřednictvím průzkumu kvality života provedeného v Centru v Janově. Častěji je bolest lokalizována v bederních obratlích, bývá popisována invalidními obrazy a je nutno ji označovat jako osteoporózu obratlových těl.

Výskyt spontánních zlomenin pozorovaných ve specializovaných centrech zabývajících se těmito patologiemi se zvyšuje.

Thalassemia Intermedia je eterogenní klinická jednotka zahrnující širokou škálu fenotypů od mírných až po těžké formy. U mírných forem se hladiny hemoglobinu pohybují mezi 8-9 g/dl, což je stabilní bez nutnosti pravidelné transfuzní terapie, pokud interkurentní epizoda nezhorší anémii; není pozorována expanze kostní dřeně. Naproti tomu existují formy, u kterých je anémie trvale závažnější (6,5-7,5 g/dl) s výraznou neúčinnou erytropoézou. V těchto případech, zejména pokud je diagnóza stanovena v dětství, by pacienti měli dostávat transfuzní režim podobný hlavním formám s podobnými komplikacemi, jako je osteoporóza.

Z těchto důvodů je u pacientů postižených těžkou thalassemií intermedia a thalassemií důležitá velká prevence a včasná diagnostika osteoporózy, stejně jako léčba již vzniklého onemocnění, aby se zlepšila jak kvalita života, tak očekávaná délka života.

V terapeutických zkouškách dříve popsané bisfosfonáty se ukázaly jako účinné díky své schopnosti inhibovat kostní resorpci a jejich relativně málo vedlejších účinků vedoucích ke zvýšení hustoty kostí. Protože všechny předchozí studie byly provedeny na malém počtu pacientů, navrhujeme randomizovanou, otevřenou velkou multicentrickou studii k testování účinnosti Neridronátu. Možnost podávat tento lék každých 90 dní intravenózně zjednodušuje dávkovací režimy a snižuje frekvenci podávání. To jsou důležité faktory pro zlepšení adherence k léčbě u pacientů, kteří jsou již vystaveni velké denní terapeutické zátěži.

Primární cíle Primárním cílem této studie je vyhodnotit účinnost Neridronátu (aminobisfosfonátu třetí generace, u kterého bylo v několika klinických studiích prokázáno, že má schopnost inhibovat kostní resorpci zprostředkovanou osteoklasty) ke zvýšení hustoty kostní hmoty (BMD). pomocí dvojité rentgenové denzitometrie (DXA). Kostní denzitometrie bude provedena při bazálním screeningu a poté za 6, 12, 18, 24 měsíců od začátku léčby.

Sekundární cíle Účinek Neridronátu na kostní obrat bude hodnocen prostřednictvím kostní alkalické fosfatázy (BALP) a telopeptidového C-konce sérového kolagenu typu 1 (CTX-s), při screeningu a poté za 6, 12, 18, 24 měsíců od začátek léčby.

Dávkování markerů bude centralizované. Návrh studie Italská multicentrická randomizovaná, otevřená terapeutická studie hodnotící účinnost a bezpečnost Neridronátu při léčbě osteoporózy u pacientů s thalassemií major a těžkou thalassemií intermedia.

Účinnost a bezpečnost léku bude hodnocena měřením při každé návštěvě těchto parametrů:

• hematologické: Hemochrom
• krevní chemie: kreatinin, BUN, AST, ALT, Ca, P, elektroforéza proteinů, celkové proteiny.

Prevalence ektopické kalcifikace a syndromu podobného pseudoxantoma elasticum (PXE) a jejich sledování bude hodnoceno na začátku studie vs. 24 měsíců pomocí fyzikálního vyšetření, echografie břicha a vyšetření očního pozadí.

Během studie budou zaznamenány další známé rizikové faktory pro osteoporózu, včetně prevalence a incidence zlomenin kostí, a pokud budou provedeny, Polimorfismy COLIA1 Na začátku studie a ve 12. a 24. měsíci morfometrie DXA pro hodnocení přítomnosti kostních deformit Dále budou vyhodnocena data týkající se QOL a symptomů bolesti po podání škály SF-36.

Během studie budou zaznamenávány všechny nežádoucí příhody

Rozšiřující studium:

Cíle nástavbového studia

1. In vitro analýza účinků přetížení železem a chelatačních molekul na růst mezenchymálních kmenových buněk a osteogenní diferenciaci
2. Hodnocení účinků neridronátu na normální a talasemickou proliferaci a diferenciaci MSC.
3. Fenotypická charakterizace MSC připravených z thalassemických pacientů léčených neridronátem nebo bez něj Návrh studie A. In vitro analýza účinků přetížení železem a chelatačních molekul na růst MSC a osteogenní diferenciaci B. Hodnocení účinků neridronátu na normální a thalasemickou proliferaci MSC a diferenciace.

C. Fenotypická charakterizace MSC připravených z thalassemických pacientů léčených neridronátem nebo bez něj A. In vitro analýza účinků přetížení železem a chelatačních molekul na růst MSC a osteogenní diferenciaci

1. Příprava sbírky mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně od normálních subjektů K izolaci a přípravě MSC použijeme protokol podrobně popsaný v Oliva et. al. (Molec. a Cell. Biochem., 2003, 247:55-60). Podrobnosti o přípravě MSC jsou uvedeny v přílohách.

   Buňky exprimovaly specifické povrchové markery, jako je CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, a byly negativní na markery hematopoetických buněk CD14, CD34 a CD45.

   Tímto způsobem připravujeme normální banku MSC, na které provádíme experimenty. V současné době máme k dispozici již více než 10 preparátů MSC od normálních subjektů.

2. Analýza účinků přetížení železem na proliferaci a diferenciaci MSC Ačkoli je dobře známo, že thalassemičtí jedinci podléhají přetížení železem, v literatuře nejsou k dispozici žádné údaje o účincích tohoto kovu na proliferaci a diferenciaci MSC. Za tímto účelem budeme postupovat, jak je uvedeno níže. Budeme hodnotit rychlost proliferace a intracelulární hladiny železa a feritinu v MSC v logaritmické fázi inkubované se zvyšujícími se koncentracemi železa, počínaje fyziologickým hematickým množstvím, tj. 2-18 mikrog/ml, až do dosažení hodnot 10krát vyšších, podobných těm, které se vyskytují u thalasemických pacientů. Budeme analyzovat účinek na rychlost růstu přímým počtem buněk, testem vitality MTT a inkorporací 3H-thymidinu (syntéza DNA).

   Následně budeme analyzovat účinky přetížení železem na hladiny hlavního proteinového produktu MSC, konkrétně kolagenu typu I, podle uvedeného protokolu. Konfluentní kultury časných pasáží (0-3) MSC, neošetřených a ošetřených přetížením železem, se tripsinizují, spočítají a odstředí při 800 xg. Pelety se resuspendují v 0,5 M kyselině octové obsahující 250 mikrog/ml pepsinu.

   Po 16 hodinách jemného třepání při 4 °C se nerozpustný zbytek peletuje při 20 000 x g po dobu 1 hodiny, solubilizuje se v provozním pufru a analyzuje se 6% SDS-PAGE. Poté jsou proteiny blotovány na nitrocelulózovou membránu a inkubovány s králičími monoklonálními protilátkami specifickými pro lidský kolagen typu I. Imunoreaktivní proužky jsou poté inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou a detekovány pomocí zesílené chemoluminiscenční techniky (ECL).

   Vliv na diferenciaci bude hodnocen analýzou exprese specifických markerů osteoblastického fenotypu, konkrétně aktivity alkalické fosfatázy a produkce osteokalcinu. Kromě toho budeme hodnotit osteogenní kapacitu MSC vyjádřenou mineralizací extracelulární matrix. Konfluentní kultury se inkubují s osteogenním médiem složeným z dexametazonu 100 nM a beta-glycerofosfátu 10 mM. Pokud je přítomna osteogenní kapacita, během 2-4 týdnů se objeví kalcifikační noduly. Pro další potvrzení mineralizace matrice změříme hladiny vápníku a nakonec provedeme specifické barvení von Kossovou metodou.

3. Analýza účinků chelatačních molekul železa na proliferaci a diferenciaci MSC Budeme hodnotit účinky DFO, která je i přes známé nevýhody a toxicitu dosud nejpoužívanější chelatační molekulou v terapii talasémie. Kultury MSC, neošetřené nebo ošetřené přetížením železem, budou přidány s DFO v koncentracích podobných těm, které byly získány in vivo po podání léku pacientům s talasemem. Budeme analyzovat vliv léčby na rychlost růstu, hladiny kolagenu typu I, aktivitu alkalické fosfatázy, produkci osteokalcinu a také osteogenní kapacitu.
4. Charakterizace složek buněčného cyklu v MSC vystavených přetížení železem a/nebo DFO Je dobře známo, že charakterizace složek buněčného cyklu představuje základ pro pochopení klíčových událostí procesů proliferace a diferenciace.

Buněčné extrakty získané z obou buněčných populací MSC ošetřených tak, jak je popsáno výše (tj. železo, DFO nebo přetížení železem a/nebo desferrioxamin) budou analyzovány imunoblotováním s použitím protilátek proti několika proteinovým složkám cyklu. Mezi nimi zejména: cyklin Dl, D2 a D3, cyklin E, cyklin A; CDK4, CDK6, CDK2 a CDK1; p16, p14, p15, p21 a p27. Dále bude analyzována fosforylace proteinu retinoblastomu a aktivity cdk.

B. Hodnocení účinků neridronátu na proliferaci a diferenciaci normálních a thalassemických MSC.

Cílem této studie bude in vitro analýza účinků neridronátu na normální a thalassemické lidské MSC. Konkrétně vyhodnotíme, zda lék testovaný v koncentracích mezi 10(-4) M a 10(-6) M, což je terapeutická dávka 10(-5) M, ovlivňuje životaschopnost, proliferaci a buněčnou aktivitu MSC. Účinky na proliferaci budou hodnoceny z hlediska inkorporace 3H-thymidinu, testu MTT a modulace motoru buněčného cyklu. Vliv na diferenciaci bude hodnocen analýzou exprese specifických markerů, konkrétně hladin kolagenu typu I, aktivity alkalické fosfatázy a produkce osteokalcinu. Kromě toho budeme hodnotit osteogenní kapacitu MSC vyjádřenou mineralizací extracelulární matrix, měřením hladin vápníku a von Kossovým barvením.

C. Fenotypická charakterizace MSC připravených z thalasemických pacientů léčených neridronátem nebo bez něj Cílem této studie bude prozkoumat, zda léčba thalasemických pacientů neridronátem může pozitivně ovlivnit osteoporotický stav a zároveň zlepšit osteogenní kapacitu MSC. Proto připravíme MSC od thalassemických pacientů léčených nebo neléčených neridronátem a kultivujeme je standardní metodou. Konkrétně budeme analyzovat rychlost růstu, mechanismus buněčného cyklu, hladiny kolagenu, aktivitu AP a syntézu osteokalcinu. Nejdůležitější je zhodnotit mineralizaci extracelulární matrix.