A neridronát (Nerixia®) hatékonysága és biztonságossága a csontritkulás kezelésében TM-ben és TI-ben szenvedő betegeknél (Nerixia)

A vizsgálat célja Jelenleg a globális terápiás megközelítés miatt a Thalassemia Major és Severe Thalassemia Intermedia prognózisa nyitott végű. A gyermekkori rendszeres transzfúziós sémák és a korai vaskelátképző terápia megelőzi azokat a csontdeformációkat, amelyek korábban jellemezték ezt a betegséget, annak ellenére, hogy több szerző szerint a betegek nagy százaléka szenved osteopeniában-osteoporosisban. Ez a tartós szövődmény egy vagy több együttélő tényezővel magyarázható, mint például anémia, genetikai tényezők, a csontanyagcserében részt vevő nemi hormonok, vas- és kelátképző terápia, hypothyreosis, a szérum D-vitamin alacsony vagy szubnormális koncentrációja stb.

A Genova központjában végzett életminőség-felmérés eredményeként a fájdalom volt az egyetlen olyan paraméter, amely a Thalassemia majorban szenvedő betegek és az azonos korú egészséges betegek megkülönböztetésére szolgál. A fájdalom gyakrabban az ágyéki csigolyákban lokalizálódik, gyakran érvénytelen képekkel írják le, és a csigolyatestek csontritkulására utalnak.

A spontán törések incidenciája növekszik az ezen patológiákat kezelő szakközpontokban.

A Thalassemia Intermedia egy eterogén klinikai entitás, amely fenotípusok széles skáláját tartalmazza az enyhétől a súlyos formákig. Az enyhe formákban a hemoglobinszint 8-9 g/dl között mozog, ami stabil rendszeres transzfúziós kezelés nélkül, kivéve, ha egy interkurrens epizód súlyosbítja a vérszegénységet; nem figyelhető meg a csontvelő tágulása. Ezzel szemben vannak olyan formák, amelyekben a vérszegénység tartósan súlyosabb (6,5-7,5 g/dl) és kifejezetten hatástalan eritropoézissel. Ezekben az esetekben, különösen, ha a diagnózist gyermekkorban állapítják meg, a betegeknek hasonló szövődményekkel, például csontritkulással járó súlyos formákhoz hasonló transzfúziós kezelésben kell részesülniük.

Ezen okok miatt a súlyos thalassemia intermedia és thalassemia betegeknél fontos az osteoporosis jelentős megelőzése és korai diagnosztizálása, valamint a kialakult betegség kezelése az életminőség és a várható élettartam javítása érdekében.

A korábban leírt terápiás kísérletekben a biszfoszfonátok hatásosnak bizonyultak, mivel képesek gátolni a csontreszorpciót, és viszonylag kevés mellékhatásuk, amelyek a csontsűrűség növekedését eredményezik. Mivel az összes korábbi vizsgálatot kisszámú betegen végezték, javasolunk egy randomizált, nyílt elrendezésű, nagy multicentrikus vizsgálatot a Neridronate hatékonyságának tesztelésére. A gyógyszer 90 naponkénti intravénás beadásának lehetősége egyszerűsíti az adagolási rendet és csökkenti az adagolás gyakoriságát. Ezek fontos tényezők a terápia adherenciájának javításában azoknál a betegeknél, akik már nagy napi terápiás terhelésnek vannak kitéve.

Elsődleges célkitűzések A vizsgálat elsődleges célja a Neridronate (harmadik generációs amino-biszfoszfonát, amelyről több klinikai vizsgálatban bebizonyosodott, hogy képes gátolni az oszteoklasztok által közvetített csontreszorpciót) hatékonyságának értékelése a mért csonttömeg-sűrűség (BMD) növelésére. kettős röntgensugár denzitometriával (DXA). Csontdenzitometriát az alapszűréskor, majd a kezelés kezdetétől számított 6, 12, 18, 24 hónap elteltével végeznek.

Másodlagos célkitűzések A Neridronate csontcserére gyakorolt ​​hatását a csont alkalikus foszfatáz (BALP) és az 1-es típusú szerikus kollagén (CTX-k) telopeptid C-terminálisán keresztül értékelik a szűréskor, majd 6, 12, 18, 24 hónap elteltével. a kezelés kezdete.

A markerek adagolása centralizált lesz. A vizsgálat felépítése Egy olasz multicentrikus, randomizált, nyílt terápiás vizsgálat, amely a neridronát hatékonyságát és biztonságosságát értékeli az osteoporosis kezelésében major thalassemia és súlyos thalassemia intermedia betegeknél.

A gyógyszer hatékonyságát és biztonságosságát minden látogatás alkalmával értékelik a következő paraméterek mérésével:

• hematológiai: Haemochrome
• vérkémia: kreatinin, BUN, AST, ALT, Ca, P, fehérjék elektroforézis, összfehérje.

Az ectopiás meszesedés és a pseudoxantoma elasticum (PXE)-szerű szindróma prevalenciáját és azok nyomon követését fizikális vizsgálattal, hasi echográfiával és szemfenéki vizsgálattal értékeljük a vizsgálat elején, illetve 24 hónap után.

A vizsgálat során a csontritkulás egyéb ismert kockázati tényezőit is rögzítik, beleértve a csonttörések előfordulását és előfordulását, valamint, ha végrehajtják, a polimorfizmusokat COLIA1 A vizsgálat elején és a 12. és 24. hónapban DXA morfometriát a csontdeformitások jelenlétének értékelésére. Ezen túlmenően az életminőséggel és a fájdalom tüneteivel kapcsolatos adatokat az SF-36 skála beadásával értékeljük.

A vizsgálat során minden nemkívánatos eseményt rögzítenek

Kiterjesztési tanulmány:

A kiterjesztett tanulmány céljai

1. A vastúlterhelés és a kelátképző molekulák mezenchimális őssejtek növekedésére és osteogén differenciálódásra gyakorolt ​​hatásának in vitro elemzése
2. A neridronát normál és talaszémiás MSC-k proliferációjára és differenciálódására gyakorolt ​​hatásának értékelése.
3. Neridronáttal vagy anélkül kezelt talaszémiás betegekből előállított MSC-k fenotípusos jellemzése Vizsgálati terv A. A vastúlterhelés és a kelátképző molekulák MSC-k növekedésére és oszteogén differenciálódásra gyakorolt ​​hatásának in vitro elemzése B. A neridronát hatásának értékelése a normál és talaszémiás MSC-k proliferációjára és a differenciálás.

C. Neridronáttal vagy anélkül kezelt talaszémiás betegekből előállított MSC-k fenotípusos jellemzése A. A vastúlterhelés és a kelátképző molekulák MSC-k növekedésére és oszteogén differenciálódásra gyakorolt ​​hatásának in vitro elemzése

1. Normál alanyokból származó csontvelői mezenchimális őssejtek gyűjteményének elkészítése Az MSC-k izolálásához és előállításához az Oliva et. al. (Molec. és Cell. Biochem., 2003, 247:55-60). Az MSC-k előkészítésének részletei a mellékletekben találhatók.

   A sejtek specifikus felszíni markereket expresszáltak, mint például CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, és negatívak voltak a CD14, CD34 és CD45 hematopoietikus sejtmarkerekre.

   Ily módon egy normál MSC-bankot készítünk elő, amelyen a kísérletezést végezzük. Jelenleg már több mint 10 MSC készítmény áll rendelkezésünkre normál alanyokból.

2. A vas túlterhelésének az MSC-k proliferációjára és differenciálódására gyakorolt ​​hatásának elemzése Bár köztudott, hogy a talaszémiás alanyok vastúlterhelésen mennek keresztül, a szakirodalomban nem állnak rendelkezésre adatok ennek a fémnek az MSC-k proliferációjára és differenciálódására gyakorolt ​​​​hatására vonatkozóan. Ennek érdekében az alábbiak szerint járunk el. Értékelni fogjuk a proliferációs sebességet, valamint a vas és ferritin intracelluláris szintjét a növekvő vaskoncentrációval inkubált MSC-kben logaritmikus fázisban, fiziológiás hematikus mennyiségtől, azaz 2-18 mikrog/ml-től kezdve, egészen a 10-szer magasabb értékek eléréséig, hasonlóan az előfordulóakhoz. thalassemiás betegeknél. Elemezzük a növekedési sebességre gyakorolt ​​hatást közvetlen sejtszámmal, MTT vitalitásvizsgálattal és 3H-timidin beépüléssel (DNS szintézis).

   Egymás után elemezzük a vas-túlterhelés hatásait az MSC-k fő fehérjetermékének, nevezetesen az I-es típusú kollagénnek a szintjére, a közölt protokoll szerint. Az MSC-k korai passzázsainak (0-3) konfluens tenyészeteit, amelyeket nem kezeltünk és vastúlterheléssel kezeltünk, tripsinizáljuk, megszámoljuk és 800xg-vel centrifugáljuk. A pelleteket 250 mikrog/ml pepszint tartalmazó 0,5 M ecetsavban újraszuszpendáljuk.

   16 órán át 4 °C-on végzett enyhe rázás után az oldhatatlan maradékot 20 000 x g-vel 1 órán át ülepítjük, futtató pufferben szolubilizáljuk és 6%-os SDS-PAGE-val analizáljuk. Ezt követően a fehérjéket nitrocellulóz membránra blottolják, és az I. típusú humán kollagénre specifikus nyúl monoklonális antitestekkel inkubálják. Az immunreaktív sávokat ezután torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel inkubálják, és fokozott kemolumineszcens technikával (ECL) detektálják.

   A differenciálódásra gyakorolt ​​hatásokat az oszteoblaszt fenotípus specifikus markereinek, nevezetesen az alkalikus foszfatáz aktivitásnak és az oszteokalcin termelésnek az expressziójának elemzésével értékeljük. Ezenkívül értékelni fogjuk az MSC-k oszteogén kapacitását, amelyet az extracelluláris mátrix mineralizációja fejez ki. A konfluens tenyészeteket 100 nM dexametazonból és 10 mM béta-glicerofoszfátból álló oszteogén tápközeggel inkubáljuk. Osteogén kapacitás esetén 2-4 héten belül meszesedési csomók jelennek meg. A mátrix mineralizációjának további megerősítése érdekében megmérjük a kalciumszintet, és végül von Kossa módszerrel specifikus festést végzünk.

3. A vaskelátképző molekulák MSC-k proliferációjára és differenciálódására kifejtett hatásának elemzése A DFO hatásait értékeljük, amely a talaszémia terápiájában eddig leggyakrabban alkalmazott kelátképző molekula, a jól ismert hátrányai és toxicitása ellenére. A nem kezelt vagy vastúlterheléssel kezelt MSC-tenyészetekhez hasonló koncentrációban DFO-t adunk, mint a talaszémiás betegeknek in vivo gyógyszeradagolást követően. Elemezzük a kezelés hatását a növekedési ütemre, az I-es típusú kollagénszintre, az alkalikus foszfatáz aktivitásra, az oszteokalcin termelésre, valamint az oszteogén kapacitásra.
4. Sejtciklus komponensek jellemzése vastúlterhelésnek és/vagy DFO-nak kitett MSC-kben Köztudott, hogy a sejtciklus komponensek jellemzése jelenti az alapot a proliferációs és differenciálódási folyamatok sarkalatos eseményeinek megértéséhez.

Így mindkét MSC-sejtpopulációból nyert sejtkivonatok a fent leírtak szerint kezelve (azaz. vas-, DFO- vagy vas-túlterhelést és/vagy dezferrioxamint) immunoblot-vizsgálattal elemezzük, számos ciklusprotein komponens elleni antitestek felhasználásával. Közülük különösen: ciklin D1, D2 és D3, ciklin E, ciklin A; CDK4, CDK6, CDK2 és CDK1; p16, p14, p15, p21 és p27. Ezenkívül elemzik a retinoblasztóma fehérje foszforilációját és a cdk-aktivitásokat.

B. A neridronát normál és talaszémiás MSC-k proliferációjára és differenciálódására gyakorolt ​​hatásának értékelése.

A tanulmány célja a neridronát normál és talaszémiás humán MSC-kre gyakorolt ​​hatásának in vitro elemzése. Különösen azt fogjuk értékelni, hogy a 10 (-4) M és 10 (-6) M közötti koncentrációban tesztelt gyógyszer, amely 10 (-5) M a terápiás dózis, befolyásolja-e az MSC-k életképességét, proliferációját és sejtaktivitását. A proliferációra gyakorolt ​​hatásokat a 3H-timidin beépülése, az MTT-teszt és a sejtciklus-motor moduláció szempontjából értékelik. A differenciálódásra gyakorolt ​​hatást specifikus markerek expressziójának elemzésével értékeljük, nevezetesen az I. típusú kollagénszintet, az alkalikus foszfatáz aktivitást és az oszteokalcin termelést. Ezen kívül értékelni fogjuk az extracelluláris mátrix mineralizációval, a kalciumszint mérésével és a von Kossa festéssel kifejezett MSC-k oszteogén kapacitását.

C. Neridronáttal vagy anélkül kezelt talasszémiás betegekből előállított MSC-k fenotípusos jellemzése A tanulmány célja annak vizsgálata, hogy a talaszémiás betegek neridronátos kezelése pozitívan befolyásolhatja-e az oszteoporózisos állapotot, és ezzel egyidejűleg javíthatja-e a csontritkulás osteogén kapacitását. MSC-k. Ezért a neridronáttal kezelt vagy nem kezelt talaszémiás betegekből MSC-ket készítünk, és standard módszerrel tenyésztjük. Különösen a növekedési sebességet, a sejtciklus gépezetét, a kollagénszinteket, az AP aktivitást és az oszteokalcin szintézist elemezzük. A legfontosabb, hogy értékeljük az extracelluláris mátrix mineralizációját.