Eficacia y seguridad del neridronato (Nerixia®) para tratar la osteoporosis en pacientes con TM y TI (Nerixia)

Objetivo del estudio En la actualidad, debido al enfoque terapéutico global, el pronóstico de la Talasemia Mayor y la Talasemia Intermedia Severa es abierto. Regímenes transfusionales regulares desde la infancia y terapia temprana de quelación del hierro previenen las deformidades óseas que en el pasado caracterizaron esta enfermedad, aunque según varios autores un alto porcentaje de pacientes padece osteopenia-osteoporosis. Esta complicación persistente puede explicarse por uno o más factores coexistentes como anemia, factores genéticos, hormonas sexuales involucradas en el metabolismo óseo, terapia con hierro y quelación, hipotiroidismo, concentraciones séricas de vitamina D bajas o subnormales, etc.

El dolor resultó ser el único parámetro que se puede considerar para distinguir a los pacientes con Talasemia Mayor de los pacientes sanos de la misma edad a través de una encuesta sobre Calidad de Vida realizada en el Centro de Génova. Con mayor frecuencia el dolor se localiza en las vértebras lumbares, suele describirse con cuadros invalidantes y debe ser referido a osteoporosis de cuerpos vertebrales.

La incidencia de fracturas espontáneas observada en los centros especializados que tratan estas patologías es cada vez mayor.

La talasemia intermedia es una entidad clínica heterogénea que incluye una amplia gama de fenotipos, desde formas leves a graves. En las formas leves los niveles de hemoglobina oscilan entre 8-9 g/dl, que es estable sin necesidad de terapia transfusional regular a menos que un episodio intercurrente agrave la anemia; no se observa expansión de la médula ósea. Por el contrario, existen formas en las que la anemia es persistentemente más severa (6,5-7,5 g/dl) con una eritropoyesis marcadamente ineficaz. En estos casos, especialmente cuando el diagnóstico se realiza en la infancia, los pacientes deben recibir un régimen transfusional similar a las formas Mayores con complicaciones similares como la osteoporosis.

Por estos motivos, en pacientes afectados de Talasemia Intermedia Severa y Talasemia Mayor es importante la prevención y el diagnóstico precoz de la osteoporosis, así como el tratamiento de la enfermedad establecida, tanto para mejorar la calidad de vida como la esperanza de vida.

En los ensayos terapéuticos descritos anteriormente, los bisfosfonatos han demostrado ser eficaces debido a su capacidad para inhibir la reabsorción ósea y sus efectos secundarios relativamente escasos que dan como resultado un aumento de la densidad ósea. Dado que todos los ensayos anteriores se realizaron en un pequeño número de pacientes, proponemos un gran ensayo multicéntrico aleatorizado y abierto para probar la eficacia de Neridronate. La posibilidad de administrar este fármaco cada 90 días por vía intravenosa simplifica las pautas de dosificación y reduce la frecuencia de administración. Estos son factores importantes para mejorar la adherencia a la terapia en pacientes que ya están sujetos a una gran carga terapéutica diaria.

Objetivos principales El objetivo principal de este estudio es evaluar la eficacia del Neridronato (un aminobisfosfonato de tercera generación que ha demostrado en varios ensayos clínicos que tiene la capacidad de inhibir la resorción ósea mediada por osteoclastos) para aumentar la Densidad de Masa Ósea (DMO) medida a través de la Doble densitometría de rayos X (DXA). Se realizará una densitometría ósea en el cribado basal y luego a los 6, 12, 18, 24 meses desde el inicio del tratamiento.

Objetivos secundarios El efecto de Neridronato sobre el recambio óseo se evaluará a través de la fosfatasa alcalina ósea (BALP) y el telopéptido C-terminal del colágeno sérico tipo 1 (CTX-s), en la selección y luego a los 6, 12, 18 y 24 meses desde el comienzo del tratamiento.

La dosificación de los marcadores será centralizada. Diseño del estudio Un ensayo terapéutico abierto, aleatorizado, multicéntrico italiano que evalúa la eficacia y la seguridad del neridronato en el tratamiento de la osteoporosis en pacientes con talasemia mayor y talasemia intermedia grave.

Se evaluará la eficacia y seguridad del fármaco midiendo en cada visita estos parámetros:

• hematológico: hemocromo
• química sanguínea: creatinina, BUN, AST, ALT, Ca, P, electroforesis de proteínas, proteínas totales.

Se evaluará la prevalencia de calcificación ectópica y síndrome pseudoxantoma elasticum (PXE) y su seguimiento al inicio del estudio vs 24 meses mediante examen físico, ecografía abdominal y examen de fondo de ojo.

Durante el ensayo se registrarán otros factores de riesgo conocidos para la osteoporosis, incluyendo prevalencia e incidencia de fracturas óseas y, en caso de ejecutarse, Polimorfismos COLIA1 Al inicio del estudio y a los 12 y 24 meses Morfometría DXA para la evaluación de la presencia de deformidades óseas Además, se evaluarán los datos sobre la calidad de vida y el dolor sintomático mediante la administración de la escala SF-36.

Durante el ensayo se registrarán todos los eventos adversos.

Estudio de extensión:

Objetivos del estudio de extensión

1. Análisis in vitro de los efectos de la sobrecarga de hierro y las moléculas quelantes sobre el crecimiento de células madre mesenquimales y la diferenciación osteogénica
2. Evaluación de los efectos del neridronato sobre la proliferación y diferenciación de MSC normales y talasémicas.
3. Caracterización fenotípica de las MSC preparadas a partir de pacientes talasémicos tratados con o sin neridronato Diseño del estudio A. Análisis in vitro de los efectos de la sobrecarga de hierro y las moléculas quelantes en el crecimiento de las MSC y la diferenciación osteogénica B. Evaluación de los efectos del neridronato en la proliferación de las MSC normales y talasémicas y diferenciación.

C. Caracterización fenotípica de las MSC preparadas a partir de pacientes talasémicos tratados con o sin neridronato A. Análisis in vitro de los efectos de la sobrecarga de hierro y las moléculas quelantes en el crecimiento de las MSC y la diferenciación osteogénica

1. Preparación de una colección de células madre mesenquimales de médula ósea de sujetos normales Para aislar y preparar MSC, utilizaremos el protocolo descrito en detalle en Oliva et. Alabama. (Molec. y Celda. Biochem., 2003, 247:55-60). Los detalles de la preparación de los MSC se informan en los anexos.

   Las células expresaron marcadores de superficie específicos, como CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, y fueron negativos para los marcadores de células hematopoyéticas CD14, CD34 y CD45.

   De esta forma, estamos preparando un banco de MSCs normal, sobre el que realizar la experimentación. En la actualidad, ya tenemos disponibles más de 10 preparados de MSC de sujetos normales.

2. Análisis de los efectos de la sobrecarga de hierro sobre la proliferación y diferenciación de las MSC Aunque es bien sabido que los sujetos talasémicos sufren una sobrecarga de hierro, no existen datos en la literatura sobre los efectos de este metal sobre la proliferación y diferenciación de las MSC. Para ello procederemos como se indica a continuación. Evaluaremos la tasa de proliferación y los niveles intracelulares de hierro y ferritina en CMM en fase logarítmica incubadas con concentraciones crecientes de hierro, partiendo de cantidades hemáticas fisiológicas, es decir, 2-18 microg/ml, hasta alcanzar valores 10 veces superiores, similares a los que se producen en pacientes talasémicos. Analizaremos el efecto sobre la tasa de crecimiento mediante recuento celular directo, ensayo de vitalidad MTT e incorporación de 3H-timidina (síntesis de ADN).

   Sucesivamente analizaremos los efectos de la sobrecarga de hierro sobre los niveles del principal producto proteico de las CMM, el colágeno tipo I, siguiendo el protocolo descrito. Los cultivos confluentes de pases tempranos (0-3) de MSC, no tratados y tratados con sobrecarga de hierro, se tripsinizan, cuentan y centrifugan a 800xg. Los gránulos se resuspenden en ácido acético 0,5 M que contiene 250 microg/ml de pepsina.

   Después de 16 horas de agitación suave a 4 °C, el residuo insoluble se sedimenta a 20 000 xg durante 1 hora, se solubiliza en tampón de procesamiento y se analiza mediante SDS-PAGE al 6 %. Posteriormente, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se incuban con anticuerpos monoclonales de conejo específicos para el colágeno tipo I humano. A continuación, las bandas inmunorreactivas se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante y se detectan mediante una técnica de quimioluminiscencia mejorada (ECL).

   Los efectos sobre la diferenciación se evaluarán analizando la expresión de marcadores específicos del fenotipo osteoblástico, concretamente la actividad de fosfatasa alcalina y la producción de osteocalcina. Además, evaluaremos la capacidad osteogénica de las MSC expresada por la mineralización de la matriz extracelular. Los cultivos confluentes se incuban con un medio osteogénico compuesto por dexametasona 100 nM y beta-glicerofosfato 10 mM. Si existe capacidad osteogénica, aparecen nódulos de calcificación en 2-4 semanas. Para confirmar aún más la mineralización de la matriz, mediremos los niveles de calcio y finalmente realizaremos una tinción específica por el método de von Kossa.

3. Análisis de los efectos de las moléculas quelantes del hierro sobre la proliferación y diferenciación de las MSC Evaluaremos los efectos de la DFO, que representa hasta ahora la molécula quelante más utilizada en la terapia de la talasemia a pesar de las conocidas desventajas y toxicidad. A los cultivos de MSC, no tratados o tratados con sobrecarga de hierro, se les añadirá DFO en concentraciones similares a las obtenidas in vivo tras la administración del fármaco a pacientes talasémicos. Analizaremos el efecto del tratamiento sobre la tasa de crecimiento, los niveles de colágeno tipo I, la actividad de la fosfatasa alcalina, la producción de osteocalcina, así como la capacidad osteogénica.
4. Caracterización de los componentes del ciclo celular en MSC sometidas a sobrecarga de hierro y/o DFO Es bien sabido que la caracterización de los componentes del ciclo celular representa la base para la comprensión de los eventos fundamentales de los procesos de proliferación y diferenciación.

Por lo tanto, los extractos celulares obtenidos de ambas poblaciones de células MSC tratadas como se describe anteriormente (es decir, hierro, DFO o sobrecarga de hierro y/o deferoxamina) se analizarán mediante inmunotransferencia empleando anticuerpos contra varios componentes proteicos del ciclo. Entre ellos en particular: ciclina D1, D2 y D3, ciclina E, ciclina A; CDK4, CDK6, CDK2 y CDK1; p16, p14, p15, p21 y p27. Además, se analizará la fosforilación de la proteína de retinoblastoma y las actividades de cdk.

B. Evaluación de los efectos del neridronato sobre la proliferación y diferenciación de MSC normales y talasémicas.

El objetivo de este estudio será el análisis in vitro de los efectos del neridronato en MSC humanas normales y talasémicas. En particular, evaluaremos si el fármaco, probado a concentraciones entre 10(-4) M y 10(-6) M siendo 10(-5) M la dosis terapéutica, afecta la viabilidad, proliferación y actividad celular de las MSC. Los efectos sobre la proliferación se evaluarán en términos de incorporación de 3H-timidina, prueba de MTT y modulación del motor del ciclo celular. La acción sobre la diferenciación se evaluará analizando la expresión de marcadores específicos, concretamente los niveles de colágeno tipo I, la actividad de la fosfatasa alcalina y la producción de osteocalcina. Además, evaluaremos la capacidad osteogénica de las MSC expresada por la mineralización de la matriz extracelular, por la medida de los niveles de calcio y por la tinción de von Kossa.

C. Caracterización fenotípica de MSC preparadas a partir de pacientes talasémicos tratados con o sin neridronato El objetivo de este estudio será investigar si el tratamiento de pacientes talasémicos con neridronato podría afectar positivamente la condición osteoporótica y, al mismo tiempo, mejorar la capacidad osteogénica de MSC. Por lo tanto, prepararemos MSC de pacientes talasémicos tratados o no con neridronato y las cultivaremos según el método estándar. En particular, analizaremos la tasa de crecimiento, la maquinaria del ciclo celular, los niveles de colágeno, la actividad de AP y la síntesis de osteocalcina. Lo más importante será evaluar la mineralización de la matriz extracelular.