Eficácia e Segurança do Neridronato (Nerixia®) no Tratamento da Osteoporose em Pacientes com MT e TI (Nerixia)

Objetivo do Estudo Atualmente, devido à abordagem terapêutica global, o prognóstico da Talassemia Maior e da Talassemia Intermédia Grave é indefinido. Regimes transfusionais regulares desde a infância e terapia de quelação de ferro precoce previnem as deformidades ósseas que no passado caracterizavam esta doença, embora, segundo vários autores, uma alta porcentagem de pacientes sofra de osteopenia-osteoporose. Esta complicação persistente pode ser explicada por um ou mais fatores coexistentes, como anemia, fatores genéticos, hormônios sexuais envolvidos no metabolismo ósseo, terapia de ferro e quelação, hipotireoidismo, concentrações baixas ou subnormais de vitamina D sérica, etc.

A dor tornou-se o único parâmetro que pode ser considerado para distinguir pacientes com Talassemia Maior de pacientes saudáveis ​​da mesma idade através de uma pesquisa sobre Qualidade de Vida realizada no Centro de Gênova. Mais frequentemente a dor localiza-se nas vértebras lombares, é frequentemente descrita com quadros inválidos e deve ser referida como osteoporose dos corpos vertebrais.

A incidência de fraturas espontâneas observadas nos centros especializados que tratam essas patologias está aumentando.

A talassemia intermediária é uma entidade clínica heterogênea, incluindo uma ampla gama de fenótipos, desde formas leves a graves. Nas formas leves, os níveis de hemoglobina variam entre 8-9 g/dl, o que é estável sem a necessidade de terapia transfusional regular, a menos que um episódio intercorrente agrave a anemia; nenhuma expansão da medula óssea é observada. Em contraste, existem formas em que a anemia é persistentemente mais grave (6,5-7,5 g/dl) com marcada eritropoiese ineficaz. Nesses casos, principalmente quando o diagnóstico é feito na infância, os pacientes devem receber esquema transfusional semelhante às formas Major com complicações semelhantes, como a osteoporose.

Por estas razões em pacientes afetados com Talassemia Intermediária Severa e com Talassemia Maior prevenção e diagnóstico precoce da osteoporose são importantes, bem como o tratamento da doença estabelecida, a fim de melhorar a qualidade de vida e a expectativa de vida.

Em ensaios terapêuticos previamente descritos, os bisfosfonatos demonstraram ser eficazes devido à sua capacidade para inibir a reabsorção óssea e aos seus relativamente poucos efeitos secundários que resultam num aumento da densidade óssea. Uma vez que todos os estudos anteriores foram conduzidos em um pequeno número de pacientes, propomos um grande estudo multicêntrico randomizado e aberto para testar a eficácia do Neridronato. A possibilidade de administrar essa droga a cada 90 dias por via intravenosa simplifica os esquemas posológicos e reduz a frequência de administração. Esses são fatores importantes para melhorar a adesão à terapia em pacientes já submetidos a uma pesada carga terapêutica diária.

Objetivos Primários O objetivo primário deste estudo é avaliar a eficácia do Neridronato (um aminobisfosfonato de terceira geração que provou em vários ensaios clínicos ter a capacidade de inibir a reabsorção óssea mediada por osteoclastos) para aumentar a Densidade de Massa Óssea (DMO) medida através de densitometria de raios-X duplo (DXA). A densitometria óssea será realizada na triagem basal e depois aos 6, 12, 18, 24 meses a partir do início do tratamento.

Objetivos secundários O efeito do Neridronato no remodelamento ósseo será avaliado através da fosfatase alcalina óssea (BALP) e telopeptídeo C-terminal do colágeno sérico tipo 1 (CTX-s), na triagem e depois aos 6, 12, 18, 24 meses de o início do tratamento.

A dosagem dos marcadores será centralizada. Desenho do estudo Um ensaio terapêutico italiano multicêntrico randomizado, aberto, avaliando a eficácia e a segurança do Neridronato no tratamento da osteoporose em pacientes com talassemia maior e talassemia intermediária grave.

A eficácia e a segurança do medicamento serão avaliadas medindo em cada visita estes parâmetros:

• hematológico: Hemocromo
• química do sangue: creatinina, BUN, AST, ALT, Ca, P, eletroforese de proteínas, proteínas totais.

A prevalência de calcificação ectópica e síndrome de pseudoxantoma elástico (PXE) e seu acompanhamento serão avaliados no início do estudo versus 24 meses por meio de exame físico, ecografia abdominal e exame de fundo de olho.

Durante o estudo, outros fatores de risco conhecidos para osteoporose serão registrados, incluindo prevalência e incidência de fraturas ósseas e, se executadas, Polimorfismos COLIA1 No início do estudo e nos meses 12 e 24 morfometria DXA para avaliação da presença de deformidades ósseas Além disso, dados referentes à QV e sintomas de dor serão avaliados por meio da aplicação da escala SF-36.

Durante o estudo, todos os eventos adversos serão registrados

Estudo de extensão:

Objetivos do estudo de extensão

1. Análise in vitro dos efeitos da sobrecarga de ferro e moléculas quelantes no crescimento de células-tronco mesenquimais e na diferenciação osteogênica
2. Avaliação dos efeitos do neridronato na proliferação e diferenciação de MSCs normais e talassêmicas.
3. Caracterização fenotípica de MSCs preparadas de pacientes talassêmicos tratados com ou sem neridronato Desenho do estudo A. Análise in vitro dos efeitos da sobrecarga de ferro e moléculas quelantes no crescimento e diferenciação osteogênica de MSCs B. Avaliação dos efeitos do neridronato na proliferação de MSCs normais e talassêmicas e diferenciação.

C. Caracterização fenotípica de MSCs preparadas de pacientes talassêmicos tratados com ou sem neridronato A. Análise in vitro dos efeitos da sobrecarga de ferro e moléculas quelantes no crescimento e diferenciação osteogênica de MSCs

1. Preparação de uma coleção de células-tronco mesenquimais da medula óssea de indivíduos normais Para isolar e preparar MSCs, vamos utilizar o protocolo descrito em detalhes em Oliva et. al. (Molec. e Celular. Biochem., 2003, 247:55-60). Os detalhes da preparação das MSCs são relatados em anexos.

   As células expressavam marcadores de superfície específicos, como CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, e eram negativas para marcadores de células hematopoiéticas CD14, CD34 e CD45.

   Desta forma, estamos preparando um banco de MSCs normal, no qual realizaremos a experimentação. Atualmente, já dispomos de mais de 10 preparações de MSCs de indivíduos normais.

2. Análise dos efeitos da sobrecarga de ferro na proliferação e diferenciação de MSCs Embora seja bem conhecido que indivíduos talassêmicos sofrem sobrecarga de ferro, não há dados disponíveis na literatura sobre os efeitos desse metal na proliferação e diferenciação de MSCs. Para isso procederemos conforme indicado a seguir. Avaliaremos a taxa de proliferação e os níveis intracelulares de ferro e ferritina em MSCs em fase logarítmica incubadas com concentrações crescentes de ferro, partindo de quantidades hemáticas fisiológicas, ou seja, 2-18 microg/ml, até atingir valores 10 vezes maiores, semelhantes aos que ocorrem em pacientes talassêmicos. Analisaremos o efeito na taxa de crescimento por contagem direta de células, ensaio de vitalidade MTT e incorporação de 3H-timidina (síntese de DNA).

   Sucessivamente iremos analisar os efeitos da sobrecarga de ferro nos níveis do principal produto proteico das MSCs, nomeadamente o colagénio tipo I, seguindo o protocolo relatado. Culturas confluentes de passagens iniciais (0-3) de MSCs, não tratadas e tratadas com sobrecarga de ferro, são tripsinizadas, contadas e centrifugadas a 800xg. Os pellets são ressuspensos em ácido acético 0,5 M contendo 250 microg/ml de pepsina.

   Após 16 horas de agitação suave a 4°C, o resíduo insolúvel é sedimentado a 20.000xg por 1 hora, solubilizado em tampão de execução e analisado por SDS-PAGE a 6%. Em seguida, as proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas com anticorpos monoclonais de coelho específicos para colágeno tipo I humano. As bandas imunorreativas são então incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e detectadas por meio de técnica quimioluminescente aprimorada (ECL).

   Os efeitos na diferenciação serão avaliados analisando a expressão de marcadores específicos do fenótipo osteoblástico, nomeadamente a atividade da fosfatase alcalina e a produção de osteocalcina. Além disso, avaliaremos a capacidade osteogênica de MSCs expressa pela mineralização da matriz extracelular. Culturas confluentes são incubadas com meio osteogênico composto de dexametasona 100 nM e beta-glicerofosfato 10 mM. Se houver capacidade osteogênica, os nódulos de calcificação aparecem em 2 a 4 semanas. Para confirmar ainda mais a mineralização da matriz, mediremos os níveis de cálcio e, finalmente, realizaremos uma coloração específica pelo método de von Kossa.

3. Análise dos efeitos das moléculas quelantes de ferro na proliferação e diferenciação das MSCs Avaliaremos os efeitos do DFO, que representa até o momento a molécula quelante mais utilizada na terapia da talassemia, apesar das conhecidas desvantagens e toxicidade. Culturas de MSCs, não tratadas ou tratadas com sobrecarga de ferro, serão adicionadas de DFO em concentrações semelhantes àquelas obtidas in vivo após a administração de drogas em pacientes talassêmicos. Analisaremos o efeito do tratamento na taxa de crescimento, nos níveis de colágeno tipo I, na atividade da fosfatase alcalina, na produção de osteocalcina, bem como na capacidade osteogênica.
4. Caracterização dos componentes do ciclo celular em MSCs submetidas à sobrecarga de ferro e/ou DFO Sabe-se que a caracterização dos componentes do ciclo celular representa a base para a compreensão dos eventos centrais dos processos de proliferação e diferenciação.

Assim, os extratos celulares obtidos de ambas as populações de células MSCs tratadas conforme descrito acima (ou seja, ferro, DFO ou sobrecarga de ferro e/ou desferrioxamina) serão analisados ​​por imunoblotting empregando anticorpos contra diversos componentes do ciclo protéico. Entre eles, em particular: ciclina D1, D2 e ​​D3, ciclina E, ciclina A; CDK4, CDK6, CDK2 e CDK1; p16, p14, p15, p21 e p27. Além disso, serão analisadas a fosforilação da proteína do retinoblastoma e as atividades das cdk.

B. Avaliação dos efeitos do neridronato na proliferação e diferenciação de MSCs normais e talassêmicas.

O objetivo deste estudo será a análise in vitro dos efeitos do neridronato em CTMs humanas normais e talassêmicas. Em particular, avaliaremos se a droga, testada em concentrações entre 10(-4) M e 10(-6) M sendo 10(-5) M a dose terapêutica, afeta a viabilidade, proliferação e atividade celular das MSCs. Os efeitos na proliferação serão avaliados em termos de incorporação de 3H-timidina, teste de MTT e modulação do motor do ciclo celular. A ação na diferenciação será avaliada analisando a expressão de marcadores específicos, nomeadamente os níveis de colagénio tipo I, a atividade da fosfatase alcalina e a produção de osteocalcina. Além disso, avaliaremos a capacidade osteogênica das MSCs expressa pela mineralização da matriz extracelular, pela medida dos níveis de cálcio e pela coloração de von Kossa.

C. Caracterização fenotípica de MSCs preparadas de pacientes talassêmicos tratados com ou sem neridronato O objetivo deste estudo será investigar se o tratamento de pacientes talassêmicos com neridronato pode afetar positivamente a condição osteoporótica e, ao mesmo tempo, melhorar a capacidade osteogênica de MSCs. Portanto, iremos preparar MSCs de pacientes talassêmicos tratados ou não com neridronato e cultivá-los de acordo com o método padrão. Em particular, analisaremos a taxa de crescimento, a maquinaria do ciclo celular, os níveis de colágeno, a atividade AP e a síntese de osteocalcina. Mais importante, avaliaremos a mineralização da matriz extracelular.