Neridronaatin (Nerixia®) teho ja turvallisuus osteoporoosin hoidossa potilailla, joilla on TM ja TI (Nerixia)

Tutkimuksen tarkoitus Globaalista terapeuttisesta lähestymistavasta johtuen Thalassemia Majorin ja Severe Thalassemia Intermedian ennuste on tällä hetkellä avoin. Säännölliset verensiirto-ohjelmat lapsuudesta ja varhainen rautakelaatiohoito ehkäisevät luun epämuodostumia, jotka ovat aiemmin olleet tunnusomaisia ​​tälle taudille, vaikka useiden kirjoittajien mukaan suuri osa potilaista kärsii osteopenia-osteoporoosista. Tämä jatkuva komplikaatio voi johtua yhdestä tai useammasta rinnakkaisesta tekijästä, kuten anemiasta, geneettisistä tekijöistä, luun aineenvaihduntaan osallistuvista sukupuolihormoneista, rauta- ja kelaatiohoidosta, kilpirauhasen vajaatoiminnasta, seerumin D-vitamiinin alhaisista tai alinormaaleista pitoisuuksista jne.

Genovan keskustassa tehdyn elämänlaatukyselyn perusteella kipu oli ainoa parametri, jonka voidaan katsoa erottavan thalassemia major -potilaat terveistä samanikäisistä potilaista. Useammin kipu sijoittuu lannenikamiin, sitä kuvataan usein vammaisilla kuvilla ja se on viitattava nikamien osteoporoosiin.

Näitä patologioita hoitavissa erikoiskeskuksissa havaittujen spontaanien murtumien ilmaantuvuus lisääntyy.

Thalassemia Intermedia on eterogeeninen kliininen kokonaisuus, joka sisältää laajan valikoiman fenotyyppejä lievistä vakaviin muotoihin. Lievissä muodoissa hemoglobiinitasot vaihtelevat välillä 8-9 g/dl, mikä on vakaa ilman säännöllisen verensiirtohoidon tarvetta, ellei väliaikainen episodi pahenna anemiaa; luuytimen laajenemista ei havaita. Sitä vastoin on muotoja, joissa anemia on jatkuvasti vakavampi (6,5-7,5 g/dl) ja erytropoieesi on selvästi tehotonta. Näissä tapauksissa, varsinkin kun diagnoosi tehdään lapsuudessa, potilaiden tulee saada verensiirto-ohjelma, joka on samanlainen kuin suuret muodot, joilla on samanlaisia ​​komplikaatioita, kuten osteoporoosi.

Näistä syistä potilailla, joilla on vaikea thalassemia intermedia ja talassemia. Osteoporoosin tärkeä ennaltaehkäisy ja varhainen diagnosointi ovat tärkeitä, samoin kuin vakiintuneen taudin hoito sekä elämänlaadun että elinajanodotuksen parantamiseksi.

Aiemmin kuvatuissa terapeuttisissa kokeissa bisfosfonaattien on osoitettu olevan tehokkaita johtuen niiden kyvystä estää luun resorptiota ja niiden suhteellisen harvoista sivuvaikutuksista, jotka johtavat luun tiheyden lisääntymiseen. Koska kaikki aiemmat tutkimukset tehtiin pienellä määrällä potilaita, ehdotamme satunnaistettua, avointa laajaa monikeskustutkimusta Neridronaatin tehon testaamiseksi. Mahdollisuus antaa tätä lääkettä 90 päivän välein suonensisäisesti tekee annostelusta yksinkertaisen ja vähentää antotiheyttä. Nämä ovat tärkeitä tekijöitä parantamaan hoitoon sitoutumista potilailla, jotka jo ovat altistuneet raskaalle päivittäiselle hoitokuormitukselle.

Ensisijaiset tavoitteet Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on arvioida Neridronaatin (kolmannen sukupolven aminobisfosfonaatin, jonka on useissa kliinisissä tutkimuksissa osoitettu olevan kyky estää osteoklastivälitteistä luun resorptiota) tehoa nostaa mitattua luumassatiheyttä (BMD) Double X-ray densitometrian (DXA) avulla. Luun tiheysmittaus tehdään perusseulonnassa ja sen jälkeen 6, 12, 18, 24 kuukauden kuluttua hoidon alkamisesta.

Toissijaiset tavoitteet Neridronaatin vaikutus luun kiertoon arvioidaan luun alkalisen fosfataasin (BALP) ja tyypin 1 serillisen kollageenin (CTX-sairaan) telopeptidi C-terminaalin kautta seulonnassa ja sitten 6, 12, 18, 24 kuukauden kuluttua hoidon alussa.

Markkerien annostus keskitetään. Tutkimussuunnitelma Italialainen monikeskinen satunnaistettu, avoin terapeuttinen tutkimus, jossa arvioitiin Neridronaatin tehoa ja turvallisuutta osteoporoosin hoidossa potilailla, joilla on suuri talassemia ja vaikea intermedia talassemia.

Lääkkeen teho ja turvallisuus arvioidaan mittaamalla jokaisella käynnillä nämä parametrit:

• hematologinen: hemokromi
• veren kemia: kreatiniini, BUN, AST, ALT, Ca, P, proteiinien elektroforeesi, kokonaisproteiinit.

Kohdunulkoisen kalkkeutumisen ja pseudoxantoma elasticum (PXE) -kaltaisen oireyhtymän esiintyvyys ja niiden seuranta arvioidaan tutkimuksen alussa vs. 24 kuukautta fyysisellä tutkimuksella, vatsan kaikututkimuksella ja silmänpohjan tutkimuksella.

Tutkimuksen aikana kirjataan muita tunnetuja osteoporoosin riskitekijöitä, mukaan lukien luunmurtumien esiintyvyys ja ilmaantuvuus sekä, jos ne suoritetaan, polymorfismit COLIA1 Tutkimuksen alussa ja kuukausina 12 ja 24 morfometria DXA luun epämuodostumien arvioimiseksi Lisäksi tiedot elämänlaadusta ja kipuoireista arvioidaan mittakaavan SF-36 annon kautta.

Kokeen aikana kaikki haittatapahtumat kirjataan

Laajennustutkimus:

Laajennustutkimuksen tavoitteet

1. In vitro -analyysi raudan ylikuormituksen ja kelatoivien molekyylien vaikutuksista mesenkymaalisten kantasolujen kasvuun ja osteogeeniseen erilaistumiseen
2. Neridronaatin vaikutusten arviointi normaalien ja talasseemien MSC:iden lisääntymiseen ja erilaistumiseen.
3. Neridronaatilla tai ilman niitä hoidetuista talassemisista potilaista valmistettujen MSC:iden fenotyyppinen karakterisointi. Tutkimussuunnitelma A. In vitro -analyysi raudan ylikuormituksen ja kelatoivien molekyylien vaikutuksista MSC:iden kasvuun ja osteogeeniseen erilaistumiseen B. Neridronaatin vaikutusten arviointi normaaliin ja talasseemiseen MSC:iden lisääntymiseen ja erilaistuminen.

C. Talassemisista potilaista, joita on hoidettu neridronaatilla tai ilman sitä

1. Luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen kokoelman valmistaminen normaaleista koehenkilöistä MSC:iden eristämiseksi ja valmistamiseksi käytämme protokollaa, joka on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa Oliva et. al. (Molec. ja Cell. Biochem., 2003, 247:55-60). MSC:iden valmistelun yksityiskohdat on raportoitu liitteissä.

   Solut ilmensivät spesifisiä pintamarkkereita, kuten CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, ja olivat negatiivisia hematopoieettisten solumerkkien CD14, CD34 ja CD45 suhteen.

   Tällä tavalla valmistelemme normaalia MSC-pankkia, jossa testataan. Tällä hetkellä meillä on saatavilla jo yli 10 MSC-valmistetta normaaleista koehenkilöistä.

2. Analyysi raudan ylikuormituksen vaikutuksista MSC:iden proliferaatioon ja erilaistumiseen Vaikka tiedetään hyvin, että talassemiset kohteet kärsivät raudan ylikuormituksesta, kirjallisuudessa ei ole saatavilla tietoja tämän metallin vaikutuksista MSC:iden lisääntymiseen ja erilaistumiseen. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi toimimme alla kuvatulla tavalla. Arvioimme proliferaationopeutta sekä raudan ja ferritiinin solunsisäisiä tasoja MSC:issä logaritmisessa faasissa, jota inkuboidaan kasvavilla rautapitoisuuksilla, alkaen fysiologisista hemaattisista määristä, eli 2-18 mikrog/ml, kunnes saavutetaan 10-kertaiset arvot, jotka ovat samanlaisia ​​kuin esiintyvät. talassemisilla potilailla. Analysoimme vaikutusta kasvunopeuteen suoralla solumäärällä, MTT-vitality-määrityksellä ja 3H-tymidiinin sisällyttämisellä (DNA-synteesi).

   Peräkkäin analysoimme raudan ylikuormituksen vaikutuksia MSC:iden pääproteiinituotteen, nimittäin tyypin I kollageenin, tasoihin raportoitua protokollaa noudattaen. MSC:iden varhaisten siirrosteiden (0-3) konfluentiviljelmät, joita ei ole käsitelty ja käsitelty raudan ylikuormituksella, tripsinoidaan, lasketaan ja sentrifugoidaan 800 x g:llä. Pelletit suspendoidaan uudelleen 0,5 M etikkahappoon, joka sisältää 250 mikrog/ml pepsiiniä.

   16 tunnin kevyen ravistelun jälkeen 4 °C:ssa liukenematon jäännös pelletoidaan 20 000 x g 1 tunnin ajan, liuotetaan ajopuskuriin ja analysoidaan 6 % SDS-PAGE:lla. Sen jälkeen proteiinit blotataan nitroselluloosakalvolle ja inkuboidaan kanin monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä ihmisen tyypin I kollageenille. Immunoreaktiivisia vyöhykkeitä inkuboidaan sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa ja ne havaitaan tehostetulla kemoluminesenssitekniikalla (ECL).

   Vaikutuksia erilaistumiseen arvioidaan analysoimalla osteoblastisen fenotyypin spesifisten markkerien ilmentymistä, nimittäin alkalisen fosfataasin aktiivisuutta ja osteokalsiinin tuotantoa. Lisäksi arvioimme ekstrasellulaarisen matriisin mineralisaation ilmentämien MSC:iden osteogeenisen kapasiteetin. Konfluentteja viljelmiä inkuboidaan osteogeenisen alustan kanssa, joka koostuu deksametasonista 100 nM ja beetaglyserofosfaatista 10 mM. Jos osteogeenistä kapasiteettia on, kalkkeutuma kyhmyjä ilmaantuu 2-4 viikossa. Matriisin mineralisaation vahvistamiseksi edelleen mittaamme kalsiumpitoisuudet ja lopuksi teemme erityisvärjäyksen von Kossa -menetelmällä.

3. Rautakelatoivien molekyylien vaikutusten analyysi MSC:iden proliferaatioon ja erilaistumiseen Arvioimme DFO:n vaikutuksia, joka on toistaiseksi eniten käytetty kelatoiva molekyyli talassemian hoidossa huolimatta hyvin tunnetuista haitoista ja toksisuudesta. MSC-viljelmiin, joita ei ole käsitelty tai käsitelty raudan ylikuormituksella, lisätään DFO:ta pitoisuuksina, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin ne, jotka saadaan in vivo, kun lääkettä on annettu talassemisille potilaille. Analysoimme hoidon vaikutusta kasvunopeuteen, tyypin I kollageenitasoihin, alkalisen fosfataasin aktiivisuuteen, osteokalsiinin tuotantoon sekä osteogeeniseen kapasiteettiin.
4. Solusyklin komponenttien karakterisointi MSC:issä, jotka ovat alttiina raudan ylikuormitukselle ja/tai DFO:lle. On hyvin tunnettua, että solusyklin komponenttien karakterisointi edustaa perustaa proliferaatio- ja erilaistumisprosessien keskeisten tapahtumien ymmärtämiselle.

Siten molemmista MSC-solupopulaatioista saadut soluuutteet käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla (ts. rauta, DFO tai raudan ylikuormitus ja/tai desferrioksamiini) analysoidaan immunoblottauksella käyttämällä vasta-aineita useita syklin proteiinikomponentteja vastaan. Niiden joukossa erityisesti: sykliini D1, D2 ja D3, sykliini E, sykliini A; CDK4, CDK6, CDK2 ja CDK1; p16, p14, p15, p21 ja p27. Lisäksi analysoidaan retinoblastoomaproteiinin fosforylaatio ja cdk-aktiivisuudet.

B. Neridronaatin vaikutusten arviointi normaalien ja talasseemien MSC:iden lisääntymiseen ja erilaistumiseen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on in vitro -analyysi neridronaatin vaikutuksista ihmisen normaaleihin ja talasseemiin MSC-soluihin. Erityisesti arvioimme, vaikuttaako lääke, joka on testattu pitoisuuksilla 10 (-4) M ja 10 (-6) M, joka on 10 (-5) M terapeuttinen annos, MSC:iden elinkelpoisuuteen, proliferaatioon ja soluaktiivisuuteen. Vaikutuksia proliferaatioon arvioidaan 3H-tymidiinin sisällyttämisen, MTT-testin ja solusyklimoottorin modulaation kannalta. Erilaistumisvaikutusta arvioidaan analysoimalla spesifisten merkkiaineiden ilmentymistä, nimittäin tyypin I kollageenitasoja, alkalisen fosfataasin aktiivisuutta ja osteokalsiinin tuotantoa. Lisäksi arvioimme solunulkoisen matriisin mineralisaation, kalsiumtasojen mittaamisen ja von Kossa-värjäyksen avulla ilmentyvien MSC:iden osteogeenista kapasiteettia.

C. Talassemisista potilaista valmistettujen MSC:iden fenotyyppinen karakterisointi neridronaatilla tai ilman hoitoa Tämän tutkimuksen tavoitteena on selvittää, voiko talassemisten potilaiden hoito neridronaatilla vaikuttaa positiivisesti osteoporoosiin ja samalla parantaa osteogeenistä kapasiteettia. MSC:t. Siksi valmistamme MSC:t talassemisista potilaista, joita on hoidettu tai ei neridronaatilla, ja viljelemme niitä standardimenetelmän mukaisesti. Erityisesti analysoimme kasvunopeutta, solusyklin koneistoa, kollageenitasoja, AP-aktiivisuutta ja osteokalsiinin synteesiä. Mikä tärkeintä, arvioimme solunulkoisen matriisin mineralisaation.