감소된 산소 농도가 배아 발달에 미치는 영향 평가 (LO2)

배양에서 발달 중인 배아를 위한 최적의 환경을 특성화하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 이러한 노력은 임상 배아 배양이 생체 내 환경을 모방해야 한다는 전제에 기반을 두고 있습니다. 이를 위해 연구자들은 초기 배아가 노출된 자연 환경의 모든 측면을 재현하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 이 집중적인 접근 방식은 현대 체외 수정(IVF) 실험실에서 배아 배양 시스템의 상당한 수정을 가져왔고 궁극적으로 임신률을 개선했습니다.

중요한 조사 대상이 된 한 영역은 인큐베이터 산소 농도와 초기 배아 발달 사이의 관계입니다. 산소는 배아 대사에서 중심적인 역할을 합니다. 그것의 활용을 지배하는 메커니즘은 배아 발달 단계에 달려 있습니다. 발달 첫 3일 동안 산소는 수동 확산을 통해 배아에 도달하고 농도 구배는 산화적 인산화 동안 산소 소비에 의해 조절됩니다. 내부 미토콘드리아 막의 손상된 무결성 또는 기질 가용성의 변경으로 인해 이 프로세스의 비효율성은 유해한 활성 산소 종의 과도한 생산을 초래할 수 있으며, 이는 세포 기계에 심각한 손상을 일으키고 궁극적으로 배아 정지로 이어질 수 있습니다.

배양 중인 배아가 노출되는 산소 농도도 이 섬세하게 균형 잡힌 시스템에 영향을 미치고 배아의 대사 건강을 변화시킬 수 있습니다. 역사적으로 대기 산소 농도(약 20%)는 배아 배양을 위해 인간 IVF 실험실에서 독점적으로 사용되었습니다. 그러나 이후 여러 조사에서 여성 생식 기관 내의 산소의 생리학적 농도가 대기 수준보다 훨씬 낮으며 지속적으로 <10%로 측정되는 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰은 대기 산소 농도를 배아 배양에서 5% 산소와 비교하는 여러 실험으로 이어졌습니다. 이러한 연구는 대기 중 산소에서 배양된 배아에서 유전자 발현, 단백질 분비 및 아미노산과 탄수화물의 최적이 아닌 이용에 상당한 동요가 있음을 보여주었습니다. 동일한 비교가 임상 IVF 연구에서 이루어졌으며 5% 산소에서 배양된 배아는 일관되게 임상 임신율과 출생률을 증가시키는 결과를 낳았습니다. 이 주제에 대한 메타 분석에서는 기준선 정상 출생률이 30%인 클리닉이 5% O2에서 배아를 배양할 때 13%의 개선을 기대할 수 있다고 제안했습니다.

이러한 강력한 데이터의 결과로 대부분의 최신 IVF 프로그램은 현재 5% 산소 농도에서 독점적으로 배아를 배양합니다. 그러나 일부에서는 발생 3일 후에 배아가 노출되는 산소 농도가 실제로 5% 미만이라고 제안했습니다. 이러한 데이터는 배아가 생체 내 발달 3일째에 자궁-난관 접합부를 통과한다는 생각에서 비롯됩니다. 여러 연구에 따르면 자궁의 산소 농도는 실제로 나팔관의 산소 농도보다 약 2% 더 낮습니다. 따라서 가장 생리적인 배아 배양 시스템은 배아를 3일까지 5% 산소에서 배양한 다음 5일 또는 6일에 옮겨지거나 냉동보존될 때까지 산소 농도를 2%로 감소시킵니다.

3일째 배아에 대한 최적 산소 농도의 변화는 이 발달 단계에서 볼 수 있는 배아의 대사 요구 사항의 일반적인 변화와 일치할 것입니다. 배아 게놈의 활성화는 3일째에 일어나 생합성 활성이 크게 증가합니다. 배아의 대사 행동도 이 시기에 상당히 변화합니다. 배아는 대사 전략을 산화적 인산화에서 호기성 해당과정 및 시트르산 회로의 형태로 포도당 기반 대사로 바꿉니다. 다짐이라고 하는 이 과정에서 배아는 산소 소비량이 크게 증가합니다.

여성 생식 기관의 생리적 환경은 발육 중인 착상 전 배아의 대사 요구를 반영하는 경향이 있습니다. 배아가 다져진 후 자궁에 들어갈 때 대사 전략이 바뀌기 때문에 자궁 내 산소 농도가 감소하면 배아 발달 단계의 에너지 생성 메커니즘을 가장 잘 지원할 수 있습니다. 배양에서 이러한 환경을 재현하면 배아 발달과 IVF로 인한 임신의 장기적인 건강이 향상될 수 있습니다.

실제로 연구에 기증된 배아를 사용한 최근 파일럿 연구에서는 배아가 발달 3일 후 2% 산소에서 배양되었을 때 5%에 비해 배아 발달이 개선된 것으로 나타났습니다(Kaser et al.).

제안된 연구의 목적 이 연구는 압축 후 2% 산소 농도와 5% 산소 농도에서 배양된 배아의 실험실 결과를 비교하고자 합니다. 연구 중인 주요 결과는 배반포 단계에서 진행 중인 3일차 배아의 비율이 될 것입니다(이 문서의 나머지 부분에서는 포배율로 알려짐).

A. 연구 장소:

참여하는 두 임상 센터에서 환자를 모집합니다. 난모세포 검색, 배아학, 배아 생검 및 배아 이식은 뉴저지주 생식 의학 협회의 임상 시설에서 이루어집니다. 모든 유전자 진단은 배아 능력 재단(FEC)에서 이루어집니다.

B. 연구 모집단:

체외 수정을 통해 임신을 시도하는 불임 부부. 60쌍의 커플이 연구에 등록될 것입니다(아래 샘플 크기 계산 참조).

연구 절차 실험 설계

이 연구의 목적은 발달 3일 후 배아 배양에서 2% 산소 대 5% 농도의 배아학적 영향을 평가하는 것입니다. 이와 같이 연구 관련 절차는 환자의 배아가 발달 3일차에 도달한 후에야 시작됩니다.

본 연구의 실험설계는 다음과 같다. (Figure 1)

1. 난자 채취, ICSI에 의한 수정, 분열 단계 배양(0일, 1일 및 2일)을 포함한 모든 관리는 완전히 일상적입니다.
2. 3일째 인큐베이터에서 배아를 제거하여 1) 보조 부화를 수행하고 2) 분열 단계 배지에서 배반포 배지로 배아를 변경하는 것은 우리 실험실의 표준 프로토콜입니다.

3. 보조 부화 시, 5웰 확장 배양 접시 2개가 확장 배양으로 전환되는 isolette로 이동됩니다. 이 5웰 디쉬의 구성은 다음과 같다. 배반포 배지 1mL를 5웰 접시의 중앙 웰에 넣습니다. 이 웰은 배반포 매체 방울에 배치하기 전에 절단 단계 배아를 세척하는 데만 사용됩니다. 외부 4개의 웰에는 진행 중인 배반포 배양을 위한 작은 방울이 들어 있습니다.

   연구의 일환으로 부화 보조가 완료되면 모든 배아는 중앙 웰에 배치되고 1mL의 배반포 배지에서 혼합됩니다. 저전력 배율에서 3일차 등급을 수행할 수 없는 경우 배아의 절반은 하나의 5웰 접시에 있는 외부 방울에 배치되고 절반은 다른 5웰 접시의 외부 방울에 배치됩니다. 이 두 접시는 isolette의 왼쪽과 오른쪽으로 분리됩니다. 발생학자는 "산소 무작위화"라고 표시된 상자에서 순차적으로 번호가 매겨진 불투명한 밀봉 봉투를 개봉합니다. 이 봉투에 있는 종이 조각은 발생학자에게 isolette의 왼쪽에 있는 5웰 접시를 2% 또는 5% 산소 농도 인큐베이터에 배치하도록 지시합니다. 인큐베이터 오른쪽에 있는 5웰 접시는 반대 조건으로 이동합니다.

4. 그런 다음 각 조건에서 진행 중인 3일차 배아의 수를 기록하고 데이터 평가자에게 제공합니다.
5. 배아는 일상적인 프로토콜에 따라 발달 5일째까지 전혀 검사하거나 조작하지 않습니다.
6. 배아 발생 5일 또는 6일째에 배아를 평가하고 각 조건에서 배양된 배아에 대해 진행 중인 배반포의 수를 기록합니다.
7. 진행 중인 모든 배아는 연구와 관계없이 표준 실험실 프로토콜에 따라 표준화된 기술을 사용하여 영양외배엽 생검을 받게 됩니다. 그런 다음 배아는 표준 프로토콜에 따라 포괄적인 염색체 스크리닝 결과를 사용할 수 있고 배아-자궁내막 동기화를 최적화할 수 있도록 냉동보존됩니다.
8. 이식할 정배수체 배아의 수에 관한 추가 결정은 환자에게 달려 있습니다. 이식된 배아가 노출된 배양 조건에 따라 임신 결과에 대한 데이터가 수집됩니다. 그러나 이 모든 정보는 2차 결과로 분석됩니다.
9. 임신 테스트 및 후속 조치는 변경되지 않습니다.

무작위화 스키마

단순 무작위화는 연구 기관(RMANJ)에서 독립적으로 수행됩니다. 임의의 숫자 시퀀스는 random.org에서 생성됩니다. 홀수는 A 중재(2%) 산소에 할당되고 짝수 숫자는 B 중재(5%)에 할당됩니다. 임의의 숫자 순서로 지시된 문자가 포함된 종이 조각은 순차적으로 번호가 매겨진 "산소 무작위화"라는 라벨이 붙은 불투명한 봉인된 봉투 상자에 넣습니다.

위에서 언급한 바와 같이 3일째에 배아의 절반을 하나의 5웰 접시에, 배아의 절반을 다른 5웰 접시에 넣은 후 발생학자는 해당 접시를 인큐베이터의 왼쪽과 오른쪽으로 분리합니다. 발생학자는 "산소 무작위화"라고 표시된 이 상자에서 순차적으로 번호가 매겨진 불투명한 봉인된 봉투를 개봉합니다. 이 봉투에 있는 종이 조각은 발생학자에게 isolette의 왼쪽에 있는 5웰 접시를 2% 또는 5% 산소 농도 인큐베이터에 배치하도록 지시합니다. 인큐베이터 오른쪽에 있는 5웰 접시는 반대 조건으로 이동합니다.

배아 수가 홀수인 경우 여분의 배아는 항상 왼손잡이용 5웰 접시에 넣습니다. 왼쪽 접시가 2% 또는 5%의 산소 농도로 무작위화될 확률이 같기 때문에 수치가 균등할 것으로 예상됩니다.