Bewertung der Auswirkungen einer reduzierten Sauerstoffkonzentration auf die Embryonalentwicklung (LO2)

Bei der Charakterisierung der optimalen Umgebung für einen sich entwickelnden Embryo in Kultur wurden erhebliche Fortschritte erzielt. Diese Bemühungen basierten auf der Prämisse, dass die klinische Embryonenkultur die in vivo-Umgebung nachahmen sollte. Zu diesem Zweck haben Forscher große Anstrengungen unternommen, um jeden Aspekt der natürlichen Umgebung nachzubilden, der der frühe Embryo ausgesetzt ist. Dieser fokussierte Ansatz hat zu erheblichen Modifikationen des Embryokultursystems im modernen In-vitro-Fertilisationslabor (IVF) und letztendlich zu Verbesserungen der Schwangerschaftsraten geführt.

Ein Bereich, der einer eingehenden Prüfung unterzogen wurde, ist die Beziehung zwischen der Sauerstoffkonzentration im Inkubator und der frühen embryonalen Entwicklung. Sauerstoff spielt eine zentrale Rolle im embryonalen Stoffwechsel. Der Verwertungsmechanismus ist abhängig vom Stadium der Embryonalentwicklung. Während der ersten 3 Tage der Entwicklung gelangt Sauerstoff durch passive Diffusion zum Embryo und sein Konzentrationsgradient wird durch den Sauerstoffverbrauch während der oxidativen Phosphorylierung reguliert. Ineffizienzen in diesem Prozess – aufgrund einer beeinträchtigten Integrität der inneren Mitochondrienmembran oder Änderungen der Substratverfügbarkeit – können zu einer übermäßigen Produktion schädlicher reaktiver Sauerstoffspezies führen, die erhebliche Schäden an der Zellmaschinerie verursachen und letztendlich zu einem embryonalen Stillstand führen können.

Die Sauerstoffkonzentration, der der Embryo in der Kultur ausgesetzt ist, kann sich ebenfalls auf dieses fein ausbalancierte System auswirken und die metabolische Gesundheit eines Embryos verändern. In der Vergangenheit wurde die atmosphärische Sauerstoffkonzentration (ca. 20 %) ausschließlich in menschlichen IVF-Laboren für die Embryonenkultur verwendet. Mehrere Untersuchungen ergaben jedoch später, dass die physiologische Sauerstoffkonzentration im weiblichen Fortpflanzungstrakt weit unter dem atmosphärischen Niveau liegt und konstant bei <10% gemessen wird. Diese Beobachtungen führten zu mehreren Versuchen, in denen atmosphärische Sauerstoffkonzentrationen mit 5 % Sauerstoff in der Embryokultur verglichen wurden. Diese Studien zeigten signifikante Störungen in der Genexpression, Proteinsekretion und suboptimalen Nutzung von Aminosäuren und Kohlenhydraten in Embryonen, die in atmosphärischem Sauerstoff kultiviert wurden. Dieselben Vergleiche wurden in klinischen IVF-Studien durchgeführt und zeigten, dass Embryonen, die in 5 % Sauerstoff kultiviert wurden, durchweg zu einer Erhöhung der klinischen Schwangerschaftsrate und der Lebendgeburtenrate führten. Eine Metaanalyse zu diesem Thema legte nahe, dass eine Klinik mit einer Basislebendgeburtenrate von 30 % eine Verbesserung von bis zu 13 % erwarten könnte, wenn sie Embryonen bei 5 % O2 kultiviert.

Als Ergebnis dieser überzeugenden Daten kultivieren die meisten modernen IVF-Programme jetzt ausschließlich Embryonen bei einer Sauerstoffkonzentration von 5 %. Einige haben jedoch vorgeschlagen, dass die Sauerstoffkonzentration, der der Embryo nach Tag 3 der Entwicklung ausgesetzt ist, tatsächlich weniger als 5 % beträgt. Diese Daten stammen von der Idee, dass der Embryo die utero-tubale Verbindung am Tag 3 der Entwicklung in vivo überquert. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Sauerstoffkonzentration in der Gebärmutter mit etwa 2 % tatsächlich niedriger ist als die im Eileiter. Somit würde das physiologischste Embryokultursystem Embryonen bis zum Tag 3 in 5 % Sauerstoff kultivieren und dann die Sauerstoffkonzentration bis zum Transfer oder zur Kryokonservierung am Tag 5 oder 6 auf 2 % verringern.

Eine Änderung der optimalen Sauerstoffkonzentration für einen Embryo am Tag 3 würde zu einer allgemeinen Verschiebung der metabolischen Anforderungen von Embryonen in diesem Entwicklungsstadium passen. Die Aktivierung des embryonalen Genoms erfolgt am Tag 3, was zu einer signifikanten Erhöhung der biosynthetischen Aktivität führt. Auch das Stoffwechselverhalten von Embryonen verändert sich in dieser Zeit erheblich. Der Embryo ändert seine Stoffwechselstrategie von der oxidativen Phosphorylierung zum Glucose-basierten Stoffwechsel in Form der aeroben Glykolyse und des Zitronensäurezyklus. Während dieses als Kompaktierung bezeichneten Prozesses weisen Embryonen einen stark erhöhten Sauerstoffverbrauch auf.

Die physiologische Umgebung des weiblichen Fortpflanzungstraktes spiegelt tendenziell die metabolischen Bedürfnisse des sich entwickelnden Präimplantationsembryos wider. Da der Embryo seine Stoffwechselstrategie nach der Verdichtung und beim Eintritt in die Gebärmutter ändert, ist es durchaus möglich, dass eine reduzierte Sauerstoffkonzentration in der Gebärmutter die energieproduzierenden Mechanismen dieses Stadiums der Embryonalentwicklung am besten unterstützt. Die Rekapitulation dieser Umgebung in Kultur kann die embryonale Entwicklung und die langfristige Gesundheit von Schwangerschaften infolge von IVF verbessern.

Tatsächlich zeigte eine kürzlich durchgeführte Pilotstudie unter Verwendung von Embryonen, die für die Forschung gespendet wurden, eine verbesserte Embryoentwicklung, wenn Embryonen nach dem 3. Tag der Entwicklung in 2 % Sauerstoff kultiviert wurden, verglichen mit 5 % (Kaser et al.)

Zweck der vorgeschlagenen Studie Diese Studie soll die Laborergebnisse von Embryonen vergleichen, die bei einer Sauerstoffkonzentration von 2 % und einer Sauerstoffkonzentration von 5 % nach der Verdichtung kultiviert wurden. Das primäre zu untersuchende Ergebnis ist der Anteil der Tag-3-Embryonen, die sich im Blastozystenstadium befinden (im Rest dieses Dokuments als Blastulationsrate bezeichnet).

A. Studienort:

Die Patienten werden an beiden teilnehmenden klinischen Zentren rekrutiert. Oozytenentnahme, Embryologie, Embryobiopsie und Embryotransfer werden in den klinischen Einrichtungen von Reproductive Medicine Associates in New Jersey durchgeführt. Die gesamte genetische Diagnostik wird in der Foundation for Embryonic Competence (FEC) durchgeführt.

B. Studienpopulation:

Unfruchtbare Paare, die eine Empfängnis durch In-vitro-Fertilisation versuchen. 60 Paare werden in die Studie aufgenommen (siehe Berechnung der Stichprobengröße unten).

STUDIENVERFAHREN Experimentelles Design

Der Zweck der Studie besteht darin, die embryologische Wirkung von 2 % Sauerstoff im Vergleich zu 5 % Konzentrationen in der Embryokultur nach Tag 3 der Entwicklung zu bewerten. Daher beginnen die studienbezogenen Verfahren erst, nachdem die Embryonen eines Patienten den dritten Tag der Entwicklung erreicht haben.

Das experimentelle Design für diese Studie ist wie folgt: (Abbildung 1)

1. Die gesamte Pflege, einschließlich Oozytenentnahme, Befruchtung durch ICSI und Kultur im Teilungsstadium (Tage 0, 1 und 2), wird vollständig routinemäßig durchgeführt.
2. Es ist ein Standardprotokoll in unserem Labor, Embryonen an Tag 3 aus dem Inkubator zu entfernen, um 1) assistiertes Schlüpfen durchzuführen und 2) Embryonen von Medien im Spaltungsstadium zu Blastozystenmedien zu wechseln

3. Zum Zeitpunkt des unterstützten Schlüpfens werden zwei 5-Well-Extended-Culture-Schalen zur Isolette gebracht, wo die Umstellung auf Extended-Culture stattfindet. Die Konfiguration dieser Schale mit 5 Vertiefungen ist wie folgt. Ein ml Blastozystenmedium wird in die mittlere Vertiefung der Schale mit 5 Vertiefungen gegeben. Diese Vertiefung wird nur zum Waschen von Embryonen im Teilungsstadium vor dem Einbringen in Blastozysten-Medientropfen verwendet. Die äußeren vier Vertiefungen enthalten kleine Tropfen für die laufende Blastozystenkultur.

   Als Teil der Studie werden nach Abschluss des unterstützten Schlüpfens alle Embryonen in die mittlere Vertiefung gegeben und mit 1 ml Blastozystenmedium gemischt. Bei schwacher Vergrößerung und ohne die Möglichkeit, eine Einstufung nach Tag 3 durchzuführen, wird die Hälfte der Embryonen in die äußeren Tropfen einer 5-Well-Schale und die andere Hälfte in die äußeren Tropfen der anderen 5-Well-Schale platziert. Diese beiden Schalen werden dann auf die linke und rechte Seite der Isolette getrennt. Ein Embryologe öffnet dann einen fortlaufend nummerierten, undurchsichtigen, versiegelten Umschlag aus der Schachtel mit der Aufschrift „Sauerstoff-Randomisierung“. Das Stück Papier in diesem Umschlag weist den Embryologen an, die 5-Well-Schale auf der linken Seite der Isolette entweder in den Inkubator mit 2 oder 5 % Sauerstoffkonzentration zu stellen. Die Schale mit 5 Vertiefungen auf der rechten Seite des Inkubators wechselt in den entgegengesetzten Zustand.

4. Die Anzahl der laufenden Tag-3-Embryonen in jedem Zustand wird dann aufgezeichnet und an die Datenbewerter weitergegeben.
5. Embryonen werden gemäß dem Routineprotokoll bis zum 5. Tag der Entwicklung überhaupt nicht untersucht oder manipuliert.
6. Am 5. oder 6. Tag der Embryonalentwicklung werden die Embryonen bewertet und die Anzahl der fortbestehenden Blastozysten wird für Embryonen, die in jedem Zustand kultiviert wurden, aufgezeichnet.
7. Alle laufenden Embryonen werden dann einer Trophektodermbiopsie unter Verwendung der standardisierten Technik gemäß dem Standardlaborprotokoll ohne Berücksichtigung der Studie unterzogen. Die Embryonen werden dann kryokonserviert, damit die Ergebnisse eines umfassenden Chromosomen-Screenings verfügbar sind und die embryonal-endometriale Synchronität gemäß dem Standardprotokoll optimiert wird.
8. Weitere Entscheidungen bezüglich der Anzahl der zu transferierenden euploiden Embryonen liegen beim Patienten. Daten zu Schwangerschaftsergebnissen werden gemäß den Kulturbedingungen, denen ein transferierter Embryo ausgesetzt war, erhoben. All diese Informationen werden jedoch als sekundäre Ergebnisse analysiert.
9. Schwangerschaftstests und Nachsorge werden nicht geändert.

RANDOMISIERUNGSSCHEMA

Eine einfache Randomisierung wird unabhängig am Studienzentrum (RMANJ) durchgeführt. Eine zufällige Zahlenfolge wird von random.org generiert. Ungerade Zahlen werden Intervention A (2 %) Sauerstoff und gerade Zahlen Intervention B (5 %) zugeordnet. Zettel, die den Buchstaben enthalten, der durch eine Zufallszahlenfolge diktiert wird, werden in eine Schachtel mit fortlaufend nummerierten, undurchsichtigen, versiegelten Umschlägen mit der Aufschrift „Sauerstoff-Randomisierung“ gelegt.

Wie oben erwähnt, wird der Embryologe am Tag 3, nachdem er die Hälfte der Embryonen in eine 5-Well-Schale und die Hälfte der Embryonen in eine andere 5-Well-Schale gelegt hat, diese Schalen auf der linken und rechten Seite des Inkubators trennen. Der Embryologe öffnet dann einen fortlaufend nummerierten, undurchsichtigen, versiegelten Umschlag aus dieser Schachtel mit der Aufschrift „Sauerstoff-Randomisierung“. Das Stück Papier in diesem Umschlag weist den Embryologen an, die 5-Well-Schale auf der linken Seite der Isolette entweder in den Inkubator mit 2 oder 5 % Sauerstoffkonzentration zu stellen. Die Schale mit 5 Vertiefungen auf der rechten Seite des Inkubators wechselt in den entgegengesetzten Zustand.

Im Falle einer ungeraden Anzahl von Embryonen wird der zusätzliche Embryo immer in die linkshändige 5-Well-Schale gegeben. Es wird erwartet, dass sich die Zahlen ausgleichen, da die linksseitige Schale die gleiche Wahrscheinlichkeit einer Randomisierung auf 2 oder 5 % Sauerstoffkonzentration hat.