Alkion kehitykseen kohdistuvan vähentyneen happipitoisuuden vaikutuksen arviointi (LO2)

Kehittyvän alkion optimaalisen ympäristön karakterisoinnissa kulttuurissa on edistytty merkittävästi. Nämä pyrkimykset ovat perustuneet olettamukseen, että kliinisen alkioviljelmän tulisi matkia in vivo -ympäristöä. Tätä varten tutkijat ovat tehneet paljon vaivaa luodakseen uudelleen kaikki sen luonnollisen ympäristön osat, joille varhainen alkio on alttiina. Tämä keskittynyt lähestymistapa on johtanut merkittäviin muutoksiin alkioviljelyjärjestelmässä nykyaikaisessa koeputkihedelmöityslaboratoriossa (IVF) ja viime kädessä raskauden lisääntymiseen.

Eräs merkittävän tarkastelun kohteena oleva alue on inkubaattorin happipitoisuuden ja varhaisen alkionkehityksen välinen suhde. Happella on keskeinen rooli alkion aineenvaihdunnassa. Sen käyttöä ohjaava mekanismi riippuu alkion kehitysvaiheesta. Kolmen ensimmäisen kehityspäivän aikana happi saavuttaa alkion passiivisen diffuusion kautta ja sen pitoisuusgradienttia säätelee hapenkulutus oksidatiivisen fosforylaation aikana. Tämän prosessin tehottomuudet - mikä johtuu sisäisen mitokondrioiden kalvon eheydestä tai muutoksista substraatin saatavuudessa - voi johtaa haitallisten reaktiivisten happilajien liialliseen tuotantoon, mikä voi aiheuttaa merkittäviä vaurioita solukoneistolle ja lopulta johtaa alkion pysähtymiseen.

Happipitoisuus, jolle alkio altistuu viljelmässä, voi myös vaikuttaa tähän herkästi tasapainotettuun järjestelmään ja muuttaa alkion aineenvaihdunnan terveyttä. Historiallisesti ilmakehän happipitoisuutta (noin 20 %) käytettiin yksinomaan ihmisen IVF-laboratorioissa alkioviljelyyn. Myöhemmin useissa tutkimuksissa kuitenkin havaittiin, että hapen fysiologinen pitoisuus naisen lisääntymiskanavassa on selvästi ilmakehän tason alapuolella, ja sitä mitataan jatkuvasti alle 10 prosentissa. Nämä havainnot johtivat useisiin kokeisiin, joissa verrattiin ilmakehän happipitoisuuksia 5 % happipitoisuuteen alkioviljelmässä. Nämä tutkimukset osoittivat merkittäviä häiriöitä geenien ilmentymisessä, proteiinien erittymisessä ja aminohappojen ja hiilihydraattien suboptimaalisessa käytössä ilmakehän hapessa viljellyissä alkioissa. Samat vertailut tehtiin kliinisissä IVF-tutkimuksissa ja osoittivat, että 5-prosenttisessa hapessa viljellyt alkiot johtivat johdonmukaisesti kliinisen raskauden ja elävänä syntyvyyden lisääntymiseen. Tämän aiheen meta-analyysi ehdotti, että klinikka, jonka perustason elävänä syntyvyys on 30 %, voisi odottaa jopa 13 %:n parannusta, kun alkioita viljellään 5 % O2:ssa.

Näiden vakuuttavien tietojen ansiosta useimmat nykyaikaiset IVF-ohjelmat viljelevät nyt yksinomaan alkioita 5 % happipitoisuudella. Jotkut ovat kuitenkin ehdottaneet, että happipitoisuus, jolle alkio altistuu kehityspäivän 3 jälkeen, on itse asiassa alle 5 %. Nämä tiedot ovat peräisin ajatuksesta, että alkio ylittää kohdun munanjohtimen liitoskohdan kehityspäivänä 3 in vivo. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kohdun happipitoisuus on itse asiassa pienempi kuin munanjohtimessa noin 2 %. Siten fysiologisin alkioviljelyjärjestelmä viljelisi alkioita 5-prosenttisessa hapessa päivään 3 asti ja laskeisi sitten happipitoisuuden 2 prosenttiin siirtoon tai kylmäsäilytykseen 5. tai 6. päivänä.

Alkion optimaalisen happipitoisuuden muutos päivänä 3 sopisi tässä kehitysvaiheessa havaittuun alkioiden aineenvaihduntatarpeiden yleiseen muutokseen. Alkion genomin aktivaatio tapahtuu päivänä 3, mikä saa aikaan merkittävän kasvun biosynteettisessä aktiivisuudessa. Myös alkioiden metabolinen käyttäytyminen muuttuu merkittävästi tänä aikana. Alkio muuttaa aineenvaihduntastrategiaansa oksidatiivisesta fosforylaatiosta glukoosipohjaiseen aineenvaihduntaan aerobisen glykolyysin ja sitruunahapposyklin muodossa. Tämän prosessin aikana, jota kutsutaan tiivistymiseksi, alkioiden hapenkulutus lisääntyy huomattavasti.

Naisen lisääntymiskanavan fysiologisella ympäristöllä on taipumus heijastaa kehittyvän preimplantaatioalkion metabolisia tarpeita. Kun alkio muuttaa aineenvaihduntastrategiaansa tiivistymisen jälkeen ja kohtuun tullessaan, on varmasti mahdollista, että kohdun alennettu happipitoisuus voi parhaiten tukea tämän alkionkehityksen vaiheen energiantuottomekanismeja. Tämän ympäristön yhdistäminen kulttuuriin voi parantaa alkion kehitystä ja IVF:stä johtuvien raskauksien pitkäaikaista terveyttä.

Itse asiassa äskettäinen pilottitutkimus, jossa käytettiin tutkimukseen lahjoitettuja alkioita, osoitti parantuneen alkionkehityksen, kun alkioita viljeltiin 2 % hapessa 3. kehityspäivän jälkeen verrattuna 5 %:iin (Kaser et al.)

Ehdotetun tutkimuksen tarkoitus Tässä tutkimuksessa pyritään vertailemaan laboratoriotuloksia alkioista, joita viljeltiin 2 % happipitoisuudella ja 5 % happipitoisuudella tiivistämisen jälkeen. Ensisijainen tutkimuksen kohteena oleva tulos on niiden päivän 3 alkioiden osuus, jotka ovat käynnissä blastokystivaiheessa (tunnetaan koko asiakirjan loppuosassa nimellä blastulaationopeus).

A. Tutkimuspaikka:

Potilaat rekrytoidaan molempiin osallistuviin kliinisiin keskuksiin. Munasolujen haku, embryologia, alkion biopsia ja alkionsiirto suoritetaan Reproductive Medicine Associates of New Jerseyn kliinisissä tiloissa. Kaikki geneettiset diagnostiikkatyöt tehdään säätiössä Embryonic Competence (FEC).

B. Tutkimuspopulaatio:

Hedelmättömät parit yrittävät tulla raskaaksi koeputkihedelmöityksellä. Tutkimukseen otetaan mukaan 60 paria (katso otoskoon laskenta alla).

TUTKIMUSMENETTELYT Kokeellinen suunnittelu

Tutkimuksen tarkoituksena on arvioida 2 % hapen sikiövaikutus verrattuna 5 % pitoisuuksiin alkioviljelmässä 3. kehityspäivän jälkeen. Sellaisenaan tutkimukseen liittyvät toimenpiteet alkavat vasta, kun potilaan alkiot saavuttavat 3. kehityspäivän.

Tämän tutkimuksen kokeellinen suunnittelu on seuraava: (Kuva 1)

1. Kaikki hoito, mukaan lukien munasolujen talteenotto, hedelmöitys ICSI:llä ja pilkkoutumisvaiheen viljely (päivät 0, 1 ja 2), on täysin rutiinikohtaista.
2. Laboratoriossamme on standardiprotokolla poistaa alkiot inkubaattorista päivänä 3 - 1) suorittaa avustettu kuoriutuminen ja 2) vaihtaa alkiot katkaisuvaiheen alustasta blastokystaelatusaineeksi.

3. Avustetun kuoriutumisen yhteydessä kaksi 5-kuoppaista pidennettyviljelmämaljaa tuodaan isolettiin, jossa tapahtuu siirtyminen pidennettyyn viljelyyn. Tämän 5-kuoppaisen astian kokoonpano on seuraava. Yksi ml blastokystiväliainetta asetetaan 5-kuoppaisen maljan keskikuoppaan. Tätä kuoppaa käytetään vain katkaisuvaiheen alkioiden pesuun ennen niiden sijoittamista blastokystiväliainepisaroihin. Neljä ulompaa kuoppaa sisältävät pieniä tippoja jatkuvaa blastokystiviljelyä varten.

   Osana tutkimusta, kun avustettu kuoriutuminen on valmis, kaikki alkiot sijoitetaan keskikuoppaan ja sekoitetaan 1 ml:aan blastokystaelatusainetta. Pienellä suurennuksella ja ilman kykyä suorittaa 3. päivän luokittelua, puolet alkioista asetetaan yhden 5-kuoppaisen maljan ulompiin pisaroihin ja puolet toisen 5-kuoppaisen maljan ulompiin pisaroihin. Nämä kaksi astiaa erotetaan sitten isoletin vasemmalle ja oikealle puolelle. Embryologi avaa sitten peräkkäin numeroidun, läpinäkymättömän suljetun kirjekuoren laatikosta, jossa on merkintä "happisatunnaistaminen". Tässä kirjekuoressa oleva paperi ohjaa embryologia sijoittamaan 5-kuoppaisen maljan isoletin vasemmalle puolelle joko 2- tai 5-prosenttiseen happikonsentraatioon. Inkubaattorin oikealla puolella oleva 5-kuoppainen astia menee päinvastaiseen tilaan.

4. Käynnissä olevien päivän 3 alkioiden lukumäärä kussakin tilassa rekisteröidään ja annetaan tietojen arvioijille.
5. Alkioita ei tutkita tai käsitellä ollenkaan ennen kehityspäivää 5 rutiiniprotokollan mukaisesti.
6. Alkioiden kehityksen päivänä 5 tai 6 alkiot arvioidaan ja käynnissä olevien blastokystien lukumäärä kirjataan kussakin tilassa viljellyille alkioille.
7. Kaikille meneillään oleville alkioille tehdään sitten trofektodermibiopsia käyttäen standardoitua tekniikkaa laboratoriostandardin mukaisesti riippumatta tutkimuksesta. Sitten alkiot kylmäsäilytetään, jotta kattavan kromosomiseulonnan tulokset ovat saatavilla ja alkion ja kohdun limakalvon synkronointi optimoidaan standardiprotokollan mukaisesti.
8. Muut päätökset siirrettävien euploidisten alkioiden määrästä ovat potilaan omat. Tietoja kerätään raskauden tuloksista niiden viljelyolosuhteiden mukaan, joissa siirretty alkio altistui. Kaikki nämä tiedot analysoidaan kuitenkin toissijaisina tuloksin.
9. Raskaustestejä ja seurantaa ei muuteta.

SATUNNISTUSKAAVIO

Yksinkertainen satunnaistaminen suoritetaan itsenäisesti tutkimuspaikalla (RMANJ). Random.org luo satunnaislukusarjan. Parittomat luvut osoitetaan A-toimenpiteelle (2 %) ja parilliset luvut B-toimenpiteelle (5 %). Paperipalat, jotka sisältävät satunnaislukusarjan saneleman kirjaimen, asetetaan laatikkoon, jossa on peräkkäin numeroituja, läpinäkymättömiä suljettuja kirjekuoria, joissa on merkintä "happisatunnaistaminen".

Kuten edellä mainittiin, päivänä 3, sen jälkeen kun puolet alkioista on asetettu yhdelle 5-kuoppaiselle maljalle ja puolet alkioista toiseen 5-kuoppaiseen maljaan, embryologi erottaa ne maljat inkubaattorin vasemmalle ja oikealle puolelle. Embryologi avaa sitten peräkkäin numeroidun, läpinäkymättömän suljetun kirjekuoren tästä laatikosta, jossa on merkintä "happisatunnaistaminen". Tässä kirjekuoressa oleva paperi ohjaa embryologia sijoittamaan 5-kuoppaisen maljan isoletin vasemmalle puolelle joko 2- tai 5-prosenttiseen happikonsentraatioon. Inkubaattorin oikealla puolella oleva 5-kuoppainen astia menee päinvastaiseen tilaan.

Jos alkioita on pariton määrä, ylimääräinen alkio sijoitetaan aina vasenkätiseen 5-kuoppaiseen astiaan. Lukujen odotetaan tasaantuvan, koska vasemmanpuoleisella lautasella on yhtä suuri mahdollisuus satunnaistaa 2 tai 5 % happipitoisuuteen.