A csökkent oxigénkoncentráció embrionális fejlődésre gyakorolt ​​hatásának értékelése (LO2)

Jelentős előrelépés történt a fejlődő embrió optimális környezetének jellemzésében a kultúrában. Ezek az erőfeszítések azon az előfeltevésen alapulnak, hogy a klinikai embriótenyészetnek utánoznia kell az in vivo környezetet. Ennek érdekében a nyomozók mindent megtettek annak érdekében, hogy a korai embrió természetes környezetének minden aspektusát újrateremtsék. Ez a fókuszált megközelítés az embriótenyésztés rendszerének jelentős módosításához vezetett a modern in vitro megtermékenyítési (IVF) laboratóriumban, és végső soron a terhességi arány javulásához.

Az egyik jelentős vizsgálat tárgyát képező terület az inkubátor oxigénkoncentrációja és a korai embrionális fejlődés közötti kapcsolat. Az oxigén központi szerepet játszik az embrionális anyagcserében. A felhasználását szabályozó mechanizmus az embrionális fejlődési szakasztól függ. A fejlődés első 3 napjában az oxigén passzív diffúzióval jut el az embrióhoz, és koncentrációgradiensét az oxidatív foszforiláció során fellépő oxigénfogyasztás szabályozza. Ennek a folyamatnak a hatékonysága – a belső mitokondriális membrán sértett integritása vagy a szubsztrátum hozzáférhetőségének megváltozása miatt – káros reaktív oxigénfajták túlzott termelődését eredményezheti, ami jelentős károkat okozhat a sejtrendszerben, és végső soron az embrionális leálláshoz vezethet.

Az oxigénkoncentráció, amelynek a tenyészetben lévő embrió ki van téve, szintén befolyásolhatja ezt a finoman kiegyensúlyozott rendszert, és megváltoztathatja az embrió anyagcsere-egészségét. A történelem során a légköri oxigénkoncentrációt (körülbelül 20%) kizárólag humán IVF-laboratóriumokban használták embriótenyésztésre. Ezt követően azonban számos vizsgálat azt találta, hogy a női reproduktív traktusban az oxigén fiziológiás koncentrációja jóval a légköri szint alatt van, következetesen 10% alatti értéket mértek. Ezek a megfigyelések több kísérlethez vezettek, amelyekben a légköri oxigénkoncentrációt hasonlították össze az embriótenyészetben lévő 5%-os oxigénnel. Ezek a vizsgálatok jelentős perturbációkat mutattak ki a génexpresszióban, a fehérjeszekrécióban, valamint az aminosavak és szénhidrátok szuboptimális felhasználásában a légköri oxigénben tenyésztett embriókban. Ugyanezeket az összehasonlításokat végezték el a klinikai IVF-vizsgálatokban, és kimutatták, hogy az 5%-os oxigénben tenyésztett embriók következetesen növelték a klinikai terhességi arányt és az élveszületési arányt. A téma metaanalízise azt sugallta, hogy egy 30%-os élveszületési rátával rendelkező klinika akár 13%-os javulásra is számíthat, ha az embriókat 5%-os oxigéntartalom mellett tenyésztik.

Ezen meggyőző adatok eredményeként a legtöbb modern IVF-program már kizárólag 5%-os oxigénkoncentráció mellett tenyészt embriókat. Néhányan azonban azt javasolták, hogy az oxigénkoncentráció, amelynek az embrió a fejlődés 3. napja után ki van téve, valójában 5%-nál alacsonyabb. Ezek az adatok abból az elképzelésből származnak, hogy az embrió in vivo fejlődésének 3. napján keresztezi a méh-tubális csomópontot. Számos tanulmány kimutatta, hogy az oxigén koncentrációja a méhben valójában alacsonyabb, mint a petevezetékben, körülbelül 2%. Így a legfiziológiásabb embriótenyésztő rendszer 5%-os oxigénben tenyészteti az embriókat a 3. napig, majd az oxigénkoncentrációt 2%-ra csökkenti az 5. vagy 6. napon történő átvitelig vagy mélyhűtésig.

Az embriók optimális oxigénkoncentrációjában a 3. napon bekövetkezett változás megfelel az embriók metabolikus szükségleteinek általános eltolódásának, amely a fejlődés ezen szakaszában látható. Az embrionális genom aktiválása a 3. napon következik be, ami a bioszintetikus aktivitás jelentős növekedését idézi elő. Ez idő alatt az embriók metabolikus viselkedése is jelentősen megváltozik. Az embrió megváltoztatja metabolikus stratégiáját az oxidatív foszforilációról a glükóz alapú metabolizmusra az aerob glikolízis és a citromsav ciklus formájában. A tömörítésnek nevezett folyamat során az embriók jelentősen megnövekedett oxigénfogyasztást mutatnak.

A női reproduktív traktus fiziológiai környezete a fejlődő preimplantációs embrió metabolikus szükségleteit tükrözi. Mivel az embrió a tömörítés után és a méhbe való belépéskor megváltoztatja metabolikus stratégiáját, minden bizonnyal lehetséges, hogy a méhben a csökkent oxigénkoncentráció támogatja a legjobban az embrionális fejlődés ezen szakaszának energiatermelő mechanizmusait. Ennek a környezetnek a kultúrában történő összefoglalása javíthatja az embrionális fejlődést és az IVF-ből származó terhességek hosszú távú egészségét.

Valójában egy nemrégiben végzett kísérleti tanulmány, amelyben kutatásra adományozott embriókat használtak, az embriók fejlődésének javulását mutatta ki, amikor az embriókat 2%-os oxigénben tenyésztették a fejlődés 3. napja után, szemben az 5%-kal (Kaser et al.).

A javasolt vizsgálat célja Ez a tanulmány a 2%-os és 5%-os tömörítés utáni oxigénkoncentrációval tenyésztett embriók laboratóriumi eredményeinek összehasonlítására törekszik. A vizsgált elsődleges eredmény a blasztocisztás stádiumban lévő 3. napi embriók aránya lesz (a dokumentum többi részében blastulációs arányként ismert).

A. A tanulmány helyszíne:

A betegeket mindkét részt vevő klinikai központban toborozzák. A petesejtek kinyerése, embriológia, embrióbiopszia és embriótranszfer a New Jersey-i Reproductive Medicine Associates klinikai létesítményeiben történik. Minden genetikai diagnosztika az Embrionális Kompetencia Alapítványnál (FEC) történik.

B. Vizsgálati populáció:

Meddő párok, akik in vitro megtermékenyítéssel kísérlik meg a fogantatást. A vizsgálatba 60 pár kerül be (lásd alább a mintaméret számítását).

TANULMÁNYI ELJÁRÁSOK Kísérleti tervezés

A vizsgálat célja a 2%-os oxigén embriológiai hatásának értékelése az embriótenyészet 5%-os koncentrációjával szemben a fejlődés 3. napja után. Mint ilyen, a vizsgálattal kapcsolatos eljárások csak azután kezdődnek, hogy a páciens embriói elérik a fejlődés 3. napját.

A vizsgálat kísérleti terve a következő: (1. ábra)

1. Minden ellátás, beleértve a petesejtek kinyerését, az ICSI-vel történő megtermékenyítést és a hasítási stádiumú tenyésztést (0., 1. és 2. nap), teljesen rutinszerű.
2. Laboratóriumunkban szabványos protokoll, hogy az embriókat a 3. napon távolítsuk el az inkubátorból: 1) végrehajtjuk az asszisztált keltetést és 2) az embriókat hasítási stádiumú táptalajról blasztociszta tápközegre cseréljük.

3. Az asszisztált keltetéskor két 5 lyukú kiterjesztett tenyésztőedény kerül az izolettára, ahol megtörténik az átállás kiterjesztett tenyészetre. Ennek az 5 lyukú edénynek a konfigurációja a következő. 1 ml blasztociszta táptalajt helyezünk az 5-lyukú csésze középső üregébe. Ezt a lyukat csak a hasítási stádiumú embriók mosására használják a blasztociszta tápközeg cseppekbe történő elhelyezése előtt. A külső négy lyuk kis cseppeket tartalmaz a folyamatban lévő blasztociszta tenyésztéshez.

   A vizsgálat részeként, amint az asszisztált keltetés befejeződött, az összes embriót a középső lyukba helyezik, és összekeverik az 1 ml blasztociszta táptalajban. Alacsony teljesítményű nagyításnál és a 3. napi osztályozási képesség hiányában az embriók felét az egyik 5-lyukú tálcán lévő külső cseppekbe, a felét pedig a másik 5-lyukú tányér külső cseppjeibe helyezik. Ezt a két edényt ezután az izolette bal és jobb oldalán választják el. Egy embriológus ezután felnyit egy sorszámmal ellátott, átlátszatlan lezárt borítékot az "oxigén randomizálás" feliratú dobozból. Az ebben a borítékban lévő papírlap arra utasítja az embriológust, hogy helyezze az 5 lyukú edényt az izolátum bal oldalán a 2 vagy 5%-os oxigénkoncentrációjú inkubátorba. Az inkubátor jobb oldalán található 5 lyukú edény az ellenkező állapotba kerül.

4. A folyamatban lévő 3. napon lévő embriók számát az egyes állapotokban ezután rögzítik, és átadják az adatértékelőknek.
5. Az embriókat a fejlődés 5. napjáig egyáltalán nem vizsgálják vagy manipulálják a rutin protokoll szerint.
6. Az embriófejlődés 5. vagy 6. napján az embriókat értékelik, és az egyes állapotokban tenyésztett embriókhoz rögzítik a folyamatban lévő blasztociszták számát.
7. Ezután minden folyamatban lévő embriót trofektoderma biopsziának vetnek alá a szabványos technikával a szabványos laboratóriumi protokollnak megfelelően, a tanulmánytól függetlenül. Az embriókat ezután mélyhűtéssel konzerválják, hogy rendelkezésre álljanak az átfogó kromoszóma-szűrés eredményei, és optimalizálható legyen az embrionális-endometrium szinkronja, a szabványos protokoll szerint.
8. A transzferálandó euploid embriók számával kapcsolatos további döntések a betegen múlnak. A terhesség kimenetelére vonatkozó adatokat gyűjtik az átvitt embrió tenyésztési körülményeinek megfelelően. Mindezeket az információkat azonban másodlagos eredményként elemezzük.
9. A terhességi teszt és a nyomon követés nem változik.

RANDOMIZÁCIÓS SÉMA

Az egyszerű randomizálást egymástól függetlenül hajtják végre a vizsgálati helyszínen (RMANJ). A random.org egy véletlenszám-sorozatot generál. A páratlan számok az A beavatkozáshoz (2%), a páros számok pedig a B beavatkozáshoz (5%) lesznek hozzárendelve. A véletlen számsorrend által diktált betűt tartalmazó papírdarabokat egy sorszámozott, átlátszatlan lezárt borítékokba helyezik, amelyeken az "oxigén randomizálás" felirat szerepel.

Amint fentebb megjegyeztük, a 3. napon, miután az embriók felét egy 5-lyukú edénybe, az embriók felét pedig egy másik 5-lyukú edénybe helyezték, az embriológus szétválasztja ezeket az edényeket az inkubátor bal és jobb oldalán. Az embriológus ezután felnyit egy sorszámozott, átlátszatlan lezárt borítékot ebből a dobozból, amelyen az "oxigén randomizálás" felirat szerepel. Az ebben a borítékban lévő papírlap arra utasítja az embriológust, hogy helyezze az 5 lyukú edényt az izolátum bal oldalán a 2 vagy 5%-os oxigénkoncentrációjú inkubátorba. Az inkubátor jobb oldalán található 5 lyukú edény az ellenkező állapotba kerül.

Páratlan számú embrió esetén a plusz embriót mindig a balkezes 5-lyukú edénybe helyezzük. A számok várhatóan kiegyenlítődni fognak, mivel a bal oldali edényben egyenlő esély van a véletlenszerű besorolásra 2 vagy 5%-os oxigénkoncentrációra.