Оценка влияния пониженной концентрации кислорода на эмбриональное развитие (LO2)

Значительный прогресс был достигнут в описании оптимальной среды для развития эмбриона в культуре. Эти усилия были основаны на предпосылке, что клиническая культура эмбрионов должна имитировать среду in vivo. С этой целью исследователи приложили все усилия, чтобы воссоздать каждый аспект естественной среды, в которой находится ранний эмбрион. Этот сфокусированный подход привел к значительным изменениям системы культивирования эмбрионов в современной лаборатории экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и, в конечном итоге, к повышению частоты наступления беременности.

Одной из областей, которая подверглась тщательному изучению, является взаимосвязь между концентрацией кислорода в инкубаторе и ранним эмбриональным развитием. Кислород играет центральную роль в эмбриональном метаболизме. Механизм, регулирующий его использование, зависит от стадии эмбрионального развития. В течение первых 3 дней развития кислород достигает эмбриона путем пассивной диффузии, а градиент его концентрации регулируется потреблением кислорода во время окислительного фосфорилирования. Неэффективность этого процесса — из-за нарушения целостности внутренней митохондриальной мембраны или изменения доступности субстрата — может привести к избыточному производству вредных активных форм кислорода, которые могут нанести значительный ущерб клеточному механизму и в конечном итоге привести к остановке эмбриона.

Концентрация кислорода, которой подвергается эмбрион в культуре, также может воздействовать на эту тонко сбалансированную систему и изменять метаболическое здоровье эмбриона. Исторически сложилось так, что концентрация атмосферного кислорода (примерно 20%) использовалась исключительно в лабораториях ЭКО человека для культивирования эмбрионов. Однако многочисленные исследования впоследствии показали, что физиологическая концентрация кислорода в женских половых путях значительно ниже атмосферного уровня и постоянно измеряется на уровне <10%. Эти наблюдения привели к многочисленным испытаниям, сравнивающим концентрацию кислорода в атмосфере с 5% кислорода в культуре эмбрионов. Эти исследования продемонстрировали значительные нарушения в экспрессии генов, секреции белков и субоптимальном использовании аминокислот и углеводов у эмбрионов, культивируемых в атмосферном кислороде. Те же сравнения были сделаны в клинических исследованиях ЭКО и показали, что эмбрионы, культивированные в 5% кислороде, неизменно приводили к увеличению клинической частоты наступления беременности и числа живорождений. Мета-анализ по этой теме показал, что клиника с исходным коэффициентом живорождения 30% может ожидать улучшения на 13% при культивировании эмбрионов при 5% O2.

В результате этих убедительных данных большинство современных программ ЭКО в настоящее время культивируют исключительно эмбрионы при 5% концентрации кислорода. Однако некоторые предполагают, что концентрация кислорода, которой подвергается эмбрион после 3-го дня развития, на самом деле ниже 5%. Эти данные исходят из представления о том, что эмбрион пересекает маточно-трубное соединение на 3-й день развития in vivo. Многочисленные исследования показали, что концентрация кислорода в матке на самом деле ниже, чем в маточной трубе, примерно на 2%. Таким образом, наиболее физиологичная система культивирования эмбрионов будет культивировать эмбрионы в 5% кислороде до 3-го дня, а затем снижать концентрацию кислорода до 2% до переноса или криоконсервации на 5-й или 6-й день.

Изменение оптимальной для эмбриона концентрации кислорода на 3-й день соответствовало бы общему сдвигу метаболических потребностей эмбрионов на этой стадии развития. Активация эмбрионального генома происходит на 3-й день, что вызывает значительное увеличение биосинтетической активности. Метаболическое поведение эмбрионов также существенно меняется в это время. Эмбрион меняет свою метаболическую стратегию с окислительного фосфорилирования на метаболизм, основанный на глюкозе, в форме аэробного гликолиза и цикла лимонной кислоты. Во время этого процесса, называемого уплотнением, эмбрионы значительно увеличивают потребление кислорода.

Физиологическая среда женского репродуктивного тракта имеет тенденцию отражать метаболические потребности развивающегося преимплантационного эмбриона. Поскольку эмбрион меняет свою метаболическую стратегию после уплотнения и при попадании в матку, вполне возможно, что пониженная концентрация кислорода в матке лучше всего поддерживает механизмы выработки энергии на этой стадии эмбрионального развития. Воспроизведение этой среды в культуре может улучшить эмбриональное развитие и долгосрочное здоровье беременностей, возникших в результате ЭКО.

Фактически, недавнее экспериментальное исследование с использованием эмбрионов, пожертвованных для исследований, продемонстрировало улучшение развития эмбрионов, когда эмбрионы культивировались в 2% кислороде после 3-го дня развития по сравнению с 5% (Kaser et al.)

Цель предлагаемого исследования Целью данного исследования является сравнение результатов лабораторных исследований эмбрионов, культивируемых при концентрации кислорода 2% и концентрации кислорода 5% после уплотнения. Первичным исследуемым результатом будет доля эмбрионов 3-го дня, находящихся на стадии бластоцисты (известная в остальной части этого документа как частота бластуляции).

А. Место обучения:

Пациентов будут набирать в обоих участвующих клинических центрах. Извлечение ооцитов, эмбриология, биопсия эмбрионов и перенос эмбрионов будут проводиться в клинических учреждениях Reproductive Medicine Associates of New Jersey. Вся генетическая диагностика будет проходить в Фонде эмбриональной компетентности (FEC).

B. Исследуемая популяция:

Бесплодные пары, пытающиеся зачать ребенка с помощью экстракорпорального оплодотворения. В исследование будут включены 60 пар (см. расчет размера выборки ниже).

ПРОЦЕДУРЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальный план

Целью исследования является оценка эмбриологического воздействия 2% кислорода по сравнению с 5% концентрациями в культуре эмбрионов после 3 дня развития. Таким образом, процедуры, связанные с исследованием, начинаются только после того, как эмбрионы пациента достигают 3-го дня развития.

Схема эксперимента для этого исследования выглядит следующим образом: (Рисунок 1)

1. Весь уход, включая извлечение яйцеклеток, оплодотворение с помощью ИКСИ и посев на стадии дробления (дни 0, 1 и 2), будет осуществляться полностью в обычном режиме.
2. Стандартным протоколом в нашей лаборатории является удаление эмбрионов из инкубатора на 3-й день для 1) проведения вспомогательного хэтчинга и 2) замены эмбрионов со среды стадии дробления на среду для бластоцисты.

3. Во время вспомогательного хетчинга две 5-луночные чашки с расширенной культурой будут доставлены к изолетте, где будет происходить переход на расширенную культуру. Конфигурация этой 5-луночной чашки выглядит следующим образом. Один мл среды бластоцисты помещают в центральную лунку 5-луночной чашки. Эта лунка используется только для промывания эмбрионов на стадии дробления перед помещением в капли среды бластоцисты. Внешние четыре лунки содержат небольшие капли для текущего культивирования бластоцист.

   В рамках исследования после завершения вспомогательного хетчинга все эмбрионы будут помещены в центральную лунку и смешаны с 1 мл среды бластоцисты. При малом увеличении и без возможности выполнить оценку на 3-й день половина эмбрионов будет помещена во внешние капли одной 5-луночной чашки, а половина — во внешние капли другой 5-луночной чашки. Затем эти две тарелки будут разделены на левую и правую стороны изолета. Затем эмбриолог открывает последовательно пронумерованный непрозрачный запечатанный конверт из коробки с пометкой «рандомизация кислорода». Листок бумаги в этом конверте укажет эмбриологу поместить 5-луночную чашку с левой стороны изолета в инкубатор с концентрацией кислорода 2 или 5%. Чашка с 5 лунками на правой стороне инкубатора перейдет в противоположное состояние.

4. Затем будет зарегистрировано количество продолжающихся эмбрионов 3-го дня в каждом состоянии и передано оценщикам данных.
5. Эмбрионы не будут исследоваться или манипулировать вообще до 5-го дня развития в соответствии с обычным протоколом.
6. На 5-й или 6-й день развития эмбрионы оценивают и регистрируют количество развивающихся бластоцист для эмбрионов, культивируемых в каждом состоянии.
7. Затем все эмбрионы будут подвергнуты биопсии трофэктодермы с использованием стандартизированной методики в соответствии со стандартным лабораторным протоколом без учета исследования. Затем эмбрионы будут подвергнуты криоконсервации, чтобы обеспечить доступность результатов комплексного хромосомного скрининга и оптимизировать эмбрионально-эндометриальную синхронию в соответствии со стандартным протоколом.
8. Дальнейшие решения относительно количества эуплоидных эмбрионов для переноса будут приниматься пациентом. Данные об исходах беременности будут собираться в соответствии с условиями культивирования, в которых находился перенесенный эмбрион. Однако вся эта информация будет проанализирована как вторичные результаты.
9. Тестирование на беременность и последующее наблюдение не будут изменены.

СХЕМА РАНДОМИЗАЦИИ

Простая рандомизация будет проводиться независимо в исследовательском центре (RMANJ). Случайная последовательность чисел будет сгенерирована random.org. Нечетные номера будут присвоены вмешательству A (2%), кислород, а четные номера будут присвоены вмешательству B (5%). Листки бумаги, содержащие букву, продиктованную последовательностью случайных чисел, будут помещены в коробку с последовательно пронумерованными непрозрачными запечатанными конвертами с надписью «кислородная рандомизация».

Как отмечалось выше, на 3-й день, после помещения половины эмбрионов в одну 5-луночную чашку и половины эмбрионов в другую 5-луночную чашку, эмбриолог разделит эти чашки на левую и правую стороны инкубатора. Затем эмбриолог открывает последовательно пронумерованный непрозрачный запечатанный конверт из этой коробки с пометкой «рандомизация кислорода». Листок бумаги в этом конверте укажет эмбриологу поместить 5-луночную чашку с левой стороны изолета в инкубатор с концентрацией кислорода 2 или 5%. Чашка с 5 лунками на правой стороне инкубатора перейдет в противоположное состояние.

В случае нечетного числа эмбрионов дополнительный эмбрион всегда будет помещен в левостороннюю 5-луночную чашку. Ожидается, что цифры выровняются, поскольку левосторонняя чашка имеет равные шансы рандомизации для концентрации кислорода 2 или 5%.