Hodnocení vlivu snížené koncentrace kyslíku na embryonální vývoj (LO2)

Významného pokroku bylo dosaženo při charakterizaci optimálního prostředí pro vyvíjející se embryo v kultuře. Toto úsilí bylo založeno na předpokladu, že klinická kultivace embryí by měla napodobovat prostředí in vivo. Za tímto účelem vynaložili vědci velké úsilí, aby znovu vytvořili každý aspekt přirozeného prostředí, kterému je rané embryo vystaveno. Tento cílený přístup vedl k významným úpravám systému kultivace embryí v moderní laboratoři in vitro fertilizace (IVF) a nakonec ke zlepšení četnosti těhotenství.

Jednou z oblastí, která byla předmětem značného zkoumání, je vztah mezi koncentrací kyslíku v inkubátoru a raným embryonálním vývojem. Kyslík hraje ústřední roli v embryonálním metabolismu. Mechanismus, kterým se řídí jeho využití, je závislý na stádiu embryonálního vývoje. Během prvních 3 dnů vývoje se kyslík dostává k embryu pasivní difúzí a jeho koncentrační gradient je regulován spotřebou kyslíku při oxidativní fosforylaci. Neefektivita v tomto procesu - kvůli narušené integritě vnitřní mitochondriální membrány nebo změnám v dostupnosti substrátu - může vést k nadměrné produkci škodlivých reaktivních forem kyslíku, které mohou způsobit významné poškození buněčného aparátu a nakonec vést k zástavě embrya.

Koncentrace kyslíku, které je embryo v kultuře vystaveno, může také ovlivnit tento jemně vyvážený systém a změnit metabolické zdraví embrya. Historicky se koncentrace atmosférického kyslíku (přibližně 20 %) používala výhradně v lidských IVF laboratořích pro kultivaci embryí. Několik výzkumů však následně zjistilo, že fyziologická koncentrace kyslíku v ženském reprodukčním traktu je hluboko pod atmosférickými hladinami, přičemž se trvale měří <10 %. Tato pozorování vedla k několika pokusům porovnávajícím koncentrace atmosférického kyslíku s 5% kyslíkem v kultuře embryí. Tyto studie prokázaly významné poruchy v genové expresi, sekreci proteinů a suboptimální využití aminokyselin a sacharidů v embryích kultivovaných v atmosférickém kyslíku. Stejná srovnání byla provedena v klinických studiích IVF a prokázala, že embrya kultivovaná v 5% kyslíku konzistentně vedla ke zvýšení míry klinického těhotenství a počtu živých porodů. Metaanalýza tohoto tématu naznačila, že klinika s výchozí mírou živě narozených dětí 30 % by mohla očekávat zlepšení až o 13 % při kultivaci embryí při 5 % O2.

Výsledkem těchto přesvědčivých údajů je, že většina moderních IVF programů nyní výhradně kultivuje embrya při 5% koncentraci kyslíku. Někteří se však domnívají, že koncentrace kyslíku, které je embryo vystaveno po 3. dni vývoje, je ve skutečnosti nižší než 5 %. Tato data pocházejí z myšlenky, že embryo překročí uterotubální spojení v den 3 vývoje in vivo. Několik studií prokázalo, že koncentrace kyslíku v děloze je ve skutečnosti nižší než ve vejcovodu přibližně o 2 %. Nejfyziologickější systém kultivace embryí by tedy kultivoval embrya v 5% kyslíku až do dne 3 a poté snižoval koncentraci kyslíku na 2% až do přenosu nebo kryokonzervace v den 5 nebo 6.

Změna optimální koncentrace kyslíku pro embryo v den 3 by odpovídala obecnému posunu v metabolických požadavcích embryí pozorovaným v této fázi vývoje. K aktivaci embryonálního genomu dochází 3. den, což vede k významnému zvýšení biosyntetické aktivity. Během této doby se také podstatně mění metabolické chování embryí. Embryo mění svou metabolickou strategii z oxidativní fosforylace na metabolismus založený na glukóze ve formě aerobní glykolýzy a cyklu kyseliny citrónové. Během tohoto procesu, nazývaného zhutňování, embrya vykazují značně zvýšenou spotřebu kyslíku.

Fyziologické prostředí ženského reprodukčního traktu má tendenci odrážet metabolické potřeby vyvíjejícího se preimplantačního embrya. Vzhledem k tomu, že embryo po zhutnění a vstupu do dělohy posune svou metabolickou strategii, je jistě možné, že snížená koncentrace kyslíku v děloze může nejlépe podpořit mechanismy produkující energii v této fázi embryonálního vývoje. Rekapitulace tohoto prostředí v kultuře může zlepšit embryonální vývoj a dlouhodobé zdraví těhotenství v důsledku IVF.

Nedávná pilotní studie s použitím embryí darovaných pro výzkum prokázala zlepšený vývoj embryí, když byla embrya kultivována ve 2% kyslíku po 3. dni vývoje ve srovnání s 5% (Kaser et al.)

Účel navrhované studie Tato studie se snaží porovnat laboratorní výsledky embryí kultivovaných při 2% koncentraci kyslíku a 5% koncentraci kyslíku po zhutnění. Primárním sledovaným výsledkem bude podíl embryí 3. dne, která probíhají ve fázi blastocysty (známá ve zbytku tohoto dokumentu jako míra blastulace).

A. Místo studia:

Nábor pacientů bude probíhat v obou zúčastněných klinických centrech. Odebírání oocytů, embryologie, biopsie embryí a přenos embryí budou probíhat v klinických zařízeních Reproductive Medicine Associates v New Jersey. Veškerá genetická diagnostika bude probíhat v Foundation for Embryonic Competence (FEC).

B. Studijní populace:

Neplodné páry pokoušející se o početí pomocí in vitro fertilizace. Do studie bude zařazeno 60 párů (viz výpočet velikosti vzorku níže).

STUDIJNÍ POSTUPY Experimentální design

Účelem studie je vyhodnotit embryologický dopad 2% kyslíku oproti 5% koncentracím v kultuře embryí po 3. dni vývoje. Postupy související se studií jako takové začínají až poté, co embrya pacienta dosáhnou 3. dne vývoje.

Experimentální uspořádání pro tuto studii je následující: (Obrázek 1)

1. Veškerá péče včetně odběru oocytů, fertilizace pomocí ICSI a kultivace ve fázi štěpení (dny 0, 1 a 2) bude zcela běžná.
2. V naší laboratoři je standardním protokolem odebrání embryí z inkubátoru v den 3 až 1) provedení asistovaného vylíhnutí a 2) výměna embryí z média ve fázi štěpení na médium blastocyst

3. V době asistovaného líhnutí budou dvě 5jamkové prodloužené kultivační misky přeneseny do izolety, kde proběhne přechod na rozšířenou kultivaci. Konfigurace této 5-jamkové misky je následující. Do střední jamky 5jamkové misky se umístí jeden ml média pro blastocysty. Tato jamka se používá pouze pro promytí embryí ve fázi štěpení před umístěním do kapek média blastocyst. Vnější čtyři jamky obsahují malé kapky pro probíhající kultivaci blastocyst.

   V rámci studie, jakmile je asistované vylíhnutí dokončeno, všechna embrya budou umístěna do středové jamky a smíchána s 1 ml média pro blastocysty. Při malém zvětšení a bez schopnosti provádět klasifikaci 3. den bude polovina embryí umístěna do vnějších kapek v jedné 5jamkové misce a polovina bude umístěna do vnějších kapek druhé 5jamkové misky. Tyto dvě misky pak budou odděleny na levou a pravou stranu izolety. Embryolog pak otevře postupně očíslovanou, neprůhlednou zapečetěnou obálku z krabice označené "náhodností kyslíku". Kousek papíru v této obálce nasměruje embryologa k umístění 5jamkové misky na levou stranu izolety do inkubátoru s 2 nebo 5% koncentrací kyslíku. 5jamková miska na pravé straně inkubátoru přejde do opačného stavu.

4. Poté bude zaznamenán počet probíhajících embryí třetího dne v každém stavu a předán hodnotitelům dat.
5. Embrya nebudou vyšetřena ani s nimi nebude manipulováno až do 5. dne vývoje podle rutinního protokolu.
6. 5. nebo 6. den vývoje embrya budou embrya hodnocena a počet probíhajících blastocyst bude zaznamenán pro embrya kultivovaná v každém stavu.
7. Všechna probíhající embrya budou poté podrobena biopsii trofektodermu za použití standardizované techniky podle standardního laboratorního protokolu bez ohledu na studii. Embrya budou poté kryokonzervována, aby byly k dispozici výsledky z komplexního chromozomálního screeningu a aby se optimalizovala embryonální a endometriální synchronizace podle standardního protokolu.
8. Další rozhodnutí o počtu euploidních embryí k přenosu bude na pacientovi. Údaje o výsledcích těhotenství budou shromažďovány podle kultivačních podmínek, kterým bylo přenesené embryo vystaveno. Všechny tyto informace však budou analyzovány jako sekundární výsledky.
9. Těhotenské testy a sledování nebudou změněny.

NÁHODNÉ SCHÉMA

Jednoduchá randomizace bude provedena nezávisle na místě studie (RMANJ). Random.org vygeneruje posloupnost náhodných čísel. Lichá čísla budou přiřazena zásahu A (2 %) kyslíku a sudá čísla budou přiřazena zásahu B (5 %). Kusy papíru obsahující písmeno diktované náhodnou číselnou sekvencí budou umístěny do krabice s postupně očíslovanými, neprůhlednými zapečetěnými obálkami s nápisem "náhodnost kyslíku".

Jak je uvedeno výše, v den 3, po umístění poloviny embryí do jedné 5jamkové misky a poloviny embryí do další 5jamkové misky, embryolog oddělí tyto misky na levou a pravou stranu inkubátoru. Embryolog poté otevře postupně očíslovanou, neprůhlednou zapečetěnou obálku z této krabičky s označením "náhodnost kyslíku". Kousek papíru v této obálce nasměruje embryologa k umístění 5jamkové misky na levou stranu izolety do inkubátoru s 2 nebo 5% koncentrací kyslíku. 5jamková miska na pravé straně inkubátoru přejde do opačného stavu.

V případě lichého počtu embryí bude extra embryo vždy umístěno do levé 5jamkové misky. Očekává se, že se čísla vyrovnají, protože levá miska má stejnou šanci na randomizaci na 2 nebo 5% koncentraci kyslíku.