Evaluatie van de impact van verminderde zuurstofconcentratie op de embryonale ontwikkeling (LO2)

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het karakteriseren van de optimale omgeving voor een zich ontwikkelend embryo in kweek. Deze inspanningen zijn gebaseerd op de vooronderstelling dat de klinische embryocultuur de in vivo-omgeving moet nabootsen. Daartoe hebben onderzoekers zich tot het uiterste ingespannen om elk aspect van de natuurlijke omgeving waaraan het vroege embryo wordt blootgesteld, na te bootsen. Deze gerichte aanpak heeft geleid tot aanzienlijke aanpassingen van het embryokweeksysteem in het moderne laboratorium voor in-vitrofertilisatie (IVF) en uiteindelijk tot verbeteringen in de zwangerschapspercentages.

Een gebied dat veel aandacht heeft gekregen, is de relatie tussen de zuurstofconcentratie in de couveuse en de vroege embryonale ontwikkeling. Zuurstof speelt een centrale rol in het embryonale metabolisme. Het mechanisme dat het gebruik ervan regelt, is afhankelijk van het stadium van de embryonale ontwikkeling. Tijdens de eerste 3 dagen van ontwikkeling bereikt zuurstof het embryo via passieve diffusie en wordt de concentratiegradiënt gereguleerd door zuurstofverbruik tijdens oxidatieve fosforylering. Inefficiënties in dit proces - als gevolg van aangetaste integriteit van het binnenste mitochondriale membraan of veranderingen in de beschikbaarheid van substraat - kunnen leiden tot overmatige productie van schadelijke reactieve zuurstofspecies die aanzienlijke schade aan cellulaire machines kunnen veroorzaken en uiteindelijk kunnen leiden tot embryonale arrestatie.

De zuurstofconcentratie waaraan het embryo in de kweek wordt blootgesteld, kan ook van invloed zijn op dit delicaat uitgebalanceerde systeem en de metabole gezondheid van een embryo veranderen. Historisch gezien werd de zuurstofconcentratie in de lucht (ongeveer 20%) uitsluitend gebruikt in menselijke IVF-laboratoria voor de kweek van embryo's. Uit meerdere onderzoeken bleek later echter dat de fysiologische concentratie van zuurstof in het vrouwelijke voortplantingsstelsel ver onder de atmosferische niveaus ligt en consistent wordt gemeten op <10%. Deze waarnemingen leidden tot meerdere proeven waarbij de zuurstofconcentraties in de lucht werden vergeleken met 5% zuurstof in embryocultuur. Deze onderzoeken toonden significante verstoringen aan in genexpressie, eiwitsecretie en suboptimaal gebruik van aminozuren en koolhydraten in embryo's gekweekt in atmosferische zuurstof. Dezelfde vergelijkingen werden gemaakt in klinische IVF-onderzoeken en toonden aan dat embryo's gekweekt in 5% zuurstof consequent resulteerden in een toename van het aantal klinische zwangerschappen en het aantal levendgeborenen. Een meta-analyse van dit onderwerp suggereerde dat een kliniek met een baseline levend geboortecijfer van 30% een verbetering van maar liefst 13% zou kunnen verwachten bij het kweken van embryo's bij 5% O2.

Als resultaat van deze overtuigende gegevens kweken de meeste moderne IVF-programma's nu uitsluitend embryo's met een zuurstofconcentratie van 5%. Sommigen hebben echter voorgesteld dat de zuurstofconcentratie waaraan het embryo wordt blootgesteld na dag 3 van ontwikkeling in feite lager is dan 5%. Deze gegevens zijn afkomstig van het idee dat het embryo de utero-tubaire overgang passeert op dag 3 van ontwikkeling in vivo. Meerdere onderzoeken hebben aangetoond dat de zuurstofconcentratie in de baarmoeder met ongeveer 2% lager is dan die in de eileider. Het meest fysiologische embryokweeksysteem zou dus embryo's in 5% zuurstof kweken tot dag 3 en vervolgens de zuurstofconcentratie verlagen tot 2% tot overdracht of cryopreservatie op dag 5 of 6.

Een verandering in de optimale zuurstofconcentratie voor een embryo op dag 3 zou passen bij een algemene verschuiving in de metabolische vereisten van embryo's in dit ontwikkelingsstadium. Activering van het embryonale genoom vindt plaats op dag 3, wat leidt tot een significante toename van de biosynthetische activiteit. Ook het metabole gedrag van embryo's verschuift in deze tijd aanzienlijk. Het embryo verandert zijn metabolische strategie van oxidatieve fosforylering naar een op glucose gebaseerd metabolisme in de vorm van de aërobe glycolyse en de citroenzuurcyclus. Tijdens dit proces, compactie genoemd, vertonen embryo's een sterk verhoogd zuurstofverbruik.

De fysiologische omgeving van het vrouwelijke voortplantingsstelsel lijkt de metabolische behoeften van het zich ontwikkelende pre-implantatie-embryo te weerspiegelen. Aangezien het embryo zijn metabole strategie verschuift na verdichting en bij het binnengaan van de baarmoeder, is het zeker mogelijk dat een verlaagde zuurstofconcentratie in de baarmoeder de energieproducerende mechanismen van deze fase in de embryonale ontwikkeling het best ondersteunt. Het recapituleren van deze omgeving in cultuur kan de embryonale ontwikkeling en de gezondheid op lange termijn van zwangerschappen als gevolg van IVF verbeteren.

In feite toonde een recente pilootstudie, waarbij gebruik werd gemaakt van embryo's die voor onderzoek waren gedoneerd, een verbeterde embryo-ontwikkeling aan wanneer embryo's werden gekweekt in 2% zuurstof na dag 3 van ontwikkeling in vergelijking met 5% (Kaser et al.)

Doel van de voorgestelde studie Deze studie probeert laboratoriumuitkomsten te vergelijken van embryo's gekweekt bij een zuurstofconcentratie van 2% en een zuurstofconcentratie van 5% na verdichting. Het primaire resultaat dat wordt bestudeerd, is het aandeel van de embryo's van dag 3 die zich in het blastocyststadium bevinden (in de rest van dit document bekend als blastulatiesnelheid).

A. Locatie van studie:

Patiënten zullen worden geworven in beide deelnemende klinische centra. Het ophalen van eicellen, embryologie, embryobiopsie en embryotransfer zullen plaatsvinden in de klinische faciliteiten van Reproductive Medicine Associates in New Jersey. Alle genetische diagnostiek vindt plaats bij de Stichting Embryonaal Bekwaamheid (FEC).

B. Studiepopulatie:

Onvruchtbare paren die proberen zwanger te worden door middel van in-vitrofertilisatie. Er zullen 60 koppels in het onderzoek worden opgenomen (zie berekening van de steekproefomvang hieronder).

STUDIEPROCEDURES Experimenteel ontwerp

Het doel van de studie is het evalueren van de embryologische impact van 2% zuurstof versus 5% concentraties in embryocultuur na dag 3 van ontwikkeling. Als zodanig beginnen de studiegerelateerde procedures pas nadat de embryo's van een patiënt dag 3 van ontwikkeling hebben bereikt.

Het experimentele ontwerp voor deze studie is als volgt: (Figuur 1)

1. Alle zorg inclusief eicelpunctie, bevruchting door ICSI en decolleté-kweek (dag 0, 1 en 2) zal volledig routinematig zijn.
2. Het is een standaardprotocol in ons laboratorium om embryo's uit de incubator te halen op dag 3 tot 1) assisted hatching uitvoeren en 2) embryo's veranderen van media in het splitsingsstadium in media voor blastocysten

3. Op het moment van geassisteerde uitkomst worden twee uitgebreide kweekschalen met 5 putjes naar de isolette gebracht waar de omschakeling naar verlengde kweek zal plaatsvinden. De configuratie van deze schotel met 5 putjes is als volgt. Eén ml blastocyst-medium wordt in het middelste putje van de schaal met 5 putjes geplaatst. Deze put wordt alleen gebruikt voor het wassen van embryo's in het splitsingsstadium voorafgaand aan plaatsing in blastocystmediadruppels. De buitenste vier putjes bevatten kleine druppels voor een doorlopende blastocystcultuur.

   Als onderdeel van het onderzoek zullen alle embryo's, zodra het geassisteerde uitkomen is voltooid, in het middelste putje worden geplaatst en worden gemengd in de 1 ml blastocystmedia. Bij lage vergroting en zonder de mogelijkheid om dag 3-sortering uit te voeren, wordt de helft van de embryo's in de buitenste druppels van een schaal met 5 putjes geplaatst en de andere helft in de buitenste druppels van de andere schaal met 5 putjes. Deze twee schotels worden dan gescheiden aan de linker- en rechterkant van de isolette. Een embryoloog zal dan een opeenvolgend genummerde, ondoorzichtige verzegelde envelop openen uit de doos waarop staat "zuurstofrandomisatie". Het stuk papier in deze envelop zal de embryoloog instrueren om de schaal met 5 putjes aan de linkerkant van de isolette te plaatsen in de incubator met een zuurstofconcentratie van 2 of 5%. De schotel met 5 putjes aan de rechterkant van de incubator gaat naar de tegenovergestelde toestand.

4. Het aantal doorlopende embryo's van dag 3 in elke toestand zal vervolgens worden geregistreerd en aan gegevensbeoordelaars worden gegeven.
5. Embryo's worden volgens het routineprotocol helemaal niet onderzocht of gemanipuleerd tot dag 5 van de ontwikkeling.
6. Op dag 5 of 6 van de embryo-ontwikkeling worden de embryo's geëvalueerd en wordt het aantal doorgaande blastocysten geregistreerd voor de gekweekte embryo's in elke aandoening.
7. Alle doorgaande embryo's ondergaan vervolgens een trophectodermbiopsie met behulp van de gestandaardiseerde techniek volgens het standaard laboratoriumprotocol, ongeacht het onderzoek. Embryo's zullen vervolgens worden gecryopreserveerd om ervoor te zorgen dat de resultaten van uitgebreide chromosomale screening beschikbaar zijn en om de embryonale-endometriumsynchronisatie te optimaliseren, volgens het standaardprotocol.
8. Verdere beslissingen met betrekking tot het aantal euploïde embryo's dat moet worden teruggeplaatst, zijn aan de patiënt. Er zullen gegevens worden verzameld over zwangerschapsuitkomsten volgens de kweekomstandigheden waaraan een teruggeplaatst embryo werd blootgesteld. Al deze informatie zal echter worden geanalyseerd als secundaire resultaten.
9. Zwangerschapstesten en follow-up worden niet gewijzigd.

RANDOMISATIESCHEMA

Eenvoudige randomisatie zal onafhankelijk worden uitgevoerd op de onderzoekslocatie (RMANJ). Een willekeurige nummerreeks wordt gegenereerd door random.org. Oneven nummers worden toegewezen aan A-interventie (2%) zuurstof en even nummers worden toegewezen aan B-interventie (5%). Stukken papier met de letter die wordt gedicteerd door een willekeurige nummerreeks, worden in een doos met opeenvolgend genummerde, ondoorzichtige verzegelde enveloppen geplaatst met het opschrift 'zuurstofrandomisatie'.

Zoals hierboven vermeld, zal de embryoloog op dag 3, na het plaatsen van de helft van de embryo's in een schaal met 5 putjes en de helft van de embryo's in een andere schaal met 5 putjes, die schaaltjes links en rechts van de incubator scheiden. De embryoloog zal dan een opeenvolgend genummerde, ondoorzichtige verzegelde envelop uit deze doos openen met de vermelding "zuurstofrandomisatie". Het stuk papier in deze envelop zal de embryoloog instrueren om de schaal met 5 putjes aan de linkerkant van de isolette te plaatsen in de incubator met een zuurstofconcentratie van 2 of 5%. De schotel met 5 putjes aan de rechterkant van de incubator gaat naar de tegenovergestelde toestand.

Bij een oneven aantal embryo's wordt het extra embryo altijd in de linkshandige 5-wells schaal geplaatst. Verwacht wordt dat de cijfers gelijk zullen zijn, aangezien de linkszijdige schaal een gelijke kans heeft op randomisatie tot een zuurstofconcentratie van 2 of 5%.