Valutazione dell'impatto della ridotta concentrazione di ossigeno sullo sviluppo embrionale (LO2)

Sono stati compiuti progressi significativi nella caratterizzazione dell'ambiente ottimale per lo sviluppo di un embrione in coltura. Questi sforzi si sono basati sulla premessa che la coltura clinica dell'embrione dovrebbe imitare l'ambiente in vivo. A tal fine, i ricercatori hanno fatto di tutto per ricreare ogni aspetto dell'ambiente naturale a cui è esposto l'embrione precoce. Questo approccio mirato ha portato a modifiche significative del sistema di coltura dell'embrione nel moderno laboratorio di fecondazione in vitro (FIV) e, in ultima analisi, a miglioramenti nei tassi di gravidanza.

Un'area che è stata oggetto di un esame approfondito è la relazione tra la concentrazione di ossigeno nell'incubatrice e lo sviluppo embrionale precoce. L'ossigeno svolge un ruolo centrale nel metabolismo embrionale. Il meccanismo che ne regola l'utilizzo dipende dallo stadio di sviluppo embrionale. Durante i primi 3 giorni di sviluppo, l'ossigeno raggiunge l'embrione tramite diffusione passiva e il suo gradiente di concentrazione è regolato dal consumo di ossigeno durante la fosforilazione ossidativa. Le inefficienze in questo processo - dovute all'integrità compromessa della membrana mitocondriale interna o ad alterazioni nella disponibilità del substrato - possono provocare un'eccessiva produzione di specie reattive dell'ossigeno dannose che possono causare danni significativi al macchinario cellulare e portare infine all'arresto embrionale.

Anche la concentrazione di ossigeno a cui è esposto l'embrione in coltura può influire su questo sistema delicatamente equilibrato e alterare la salute metabolica di un embrione. Storicamente, la concentrazione di ossigeno atmosferico (circa il 20%) è stata utilizzata esclusivamente nei laboratori di fecondazione in vitro umana per la coltura degli embrioni. Tuttavia, più indagini hanno successivamente scoperto che la concentrazione fisiologica di ossigeno all'interno del tratto riproduttivo femminile è ben al di sotto dei livelli atmosferici, essendo costantemente misurata a <10%. Queste osservazioni hanno portato a più prove che confrontano le concentrazioni di ossigeno atmosferico al 5% di ossigeno nella coltura dell'embrione. Questi studi hanno dimostrato significative perturbazioni nell'espressione genica, nella secrezione proteica e nell'utilizzo non ottimale di aminoacidi e carboidrati negli embrioni coltivati ​​in ossigeno atmosferico. Gli stessi confronti sono stati effettuati negli studi clinici sulla fecondazione in vitro e hanno dimostrato che gli embrioni coltivati ​​in 5% di ossigeno hanno costantemente portato a un aumento del tasso di gravidanza clinica e del tasso di nati vivi. Una meta-analisi di questo argomento ha suggerito che una clinica con un tasso di nati vivi al basale del 30% potrebbe aspettarsi un miglioramento fino al 13% quando si coltivano embrioni al 5% di O2.

Come risultato di questi dati convincenti, la maggior parte dei moderni programmi di fecondazione in vitro ora coltiva esclusivamente embrioni al 5% di concentrazione di ossigeno. Tuttavia, alcuni hanno proposto che la concentrazione di ossigeno a cui è esposto l'embrione dopo il terzo giorno di sviluppo sia in realtà inferiore al 5%. Questi dati nascono dall'idea che l'embrione attraversi la giunzione utero-tubarica il giorno 3 dello sviluppo in vivo. Diversi studi hanno dimostrato che la concentrazione di ossigeno nell'utero è in realtà inferiore a quella nella tuba di Falloppio a circa il 2%. Pertanto, il sistema di coltura embrionale più fisiologico coltiverebbe gli embrioni in ossigeno al 5% fino al giorno 3 e quindi ridurrà la concentrazione di ossigeno al 2% fino al trasferimento o alla crioconservazione il giorno 5 o 6.

Un cambiamento nella concentrazione ottimale di ossigeno per un embrione il giorno 3 si adatterebbe a un cambiamento generale dei requisiti metabolici degli embrioni osservati in questa fase di sviluppo. L'attivazione del genoma embrionale si verifica il giorno 3, il che richiede un aumento significativo dell'attività biosintetica. Anche il comportamento metabolico degli embrioni cambia sostanzialmente durante questo periodo. L'embrione cambia la sua strategia metabolica dalla fosforilazione ossidativa al metabolismo basato sul glucosio sotto forma di glicolisi aerobica e ciclo dell'acido citrico. Durante questo processo, chiamato compattazione, gli embrioni mostrano un consumo di ossigeno notevolmente aumentato.

L'ambiente fisiologico del tratto riproduttivo femminile tende a rispecchiare le esigenze metaboliche dell'embrione preimpianto in via di sviluppo. Poiché l'embrione sposta la sua strategia metabolica dopo la compattazione e all'ingresso nell'utero, è certamente possibile che una ridotta concentrazione di ossigeno nell'utero possa supportare al meglio i meccanismi di produzione di energia di questa fase dello sviluppo embrionale. Ricapitolare questo ambiente nella cultura può migliorare lo sviluppo embrionale e la salute a lungo termine delle gravidanze risultanti dalla fecondazione in vitro.

Infatti un recente studio pilota, utilizzando embrioni donati alla ricerca, ha dimostrato un miglioramento dello sviluppo embrionale quando gli embrioni sono stati coltivati ​​in 2% di ossigeno dopo il terzo giorno di sviluppo rispetto al 5% (Kaser et al.)

Scopo dello studio proposto Questo studio cerca di confrontare i risultati di laboratorio di embrioni coltivati ​​al 2% di concentrazione di ossigeno e al 5% di concentrazione di ossigeno dopo la compattazione. L'esito primario oggetto di studio sarà la proporzione di embrioni del giorno 3 che sono in corso allo stadio di blastocisti (noto nel resto di questo documento come tasso di blastulazione).

A. Luogo di studio:

I pazienti saranno reclutati in entrambi i centri clinici partecipanti. Il recupero degli ovociti, l'embriologia, la biopsia embrionale e il trasferimento degli embrioni avverranno presso le strutture cliniche della Reproductive Medicine Associates del New Jersey. Tutta la diagnostica genetica avverrà presso la Foundation for Embryonic Competence (FEC).

B. Popolazione studiata:

Coppie infertili che tentano il concepimento attraverso la fecondazione in vitro. 60 coppie saranno arruolate nello studio (vedere il calcolo della dimensione del campione di seguito).

PROCEDURE DI STUDIO Disegno sperimentale

Lo scopo dello studio è valutare l'impatto embriologico del 2% di ossigeno rispetto alle concentrazioni del 5% nella coltura dell'embrione dopo il terzo giorno di sviluppo. Pertanto, le procedure relative allo studio iniziano solo dopo che gli embrioni di un paziente raggiungono il terzo giorno di sviluppo.

Il disegno sperimentale per questo studio è il seguente: (Figura 1)

1. Tutte le cure, incluso il recupero degli ovociti, la fecondazione mediante ICSI e la coltura dello stadio di scissione (giorni 0, 1 e 2) saranno completamente di routine.
2. È un protocollo standard nel nostro laboratorio per rimuovere gli embrioni dall'incubatrice il giorno 3 a 1) eseguire la schiusa assistita e 2) cambiare gli embrioni dal mezzo di scissione al mezzo di blastocisti

3. Al momento della schiusa assistita, due piatti di coltura estesa a 5 pozzetti saranno portati nell'isoletta dove avverrà il passaggio alla coltura estesa. La configurazione di questo piatto a 5 pozzetti è la seguente. Un mL di media di blastocisti viene posto nel pozzetto centrale del piatto a 5 pozzetti. Questo pozzetto viene utilizzato solo per il lavaggio degli embrioni in fase di scissione prima del posizionamento in gocce di media di blastocisti. I quattro pozzetti esterni contengono piccole gocce per la coltura di blastocisti in corso.

   Come parte dello studio, una volta completata la schiusa assistita, tutti gli embrioni verranno collocati nel pozzetto centrale e mescolati in 1 mL di terreno di blastocisti. A basso ingrandimento e senza la possibilità di eseguire la classificazione del giorno 3, metà degli embrioni verrà posizionata nelle gocce esterne in un piatto da 5 pozzetti e metà verrà posto nelle gocce esterne dell'altro piatto da 5 pozzetti. Questi due piatti saranno quindi separati sul lato sinistro e destro dell'isolette. Un embriologo aprirà quindi una busta sigillata opaca numerata in sequenza dalla scatola contrassegnata con "randomizzazione dell'ossigeno". Il pezzo di carta in questa busta indirizzerà l'embriologo a posizionare il piatto a 5 pozzetti sul lato sinistro dell'isoletta nell'incubatore a concentrazione di ossigeno del 2 o del 5%. Il piatto a 5 pozzetti sul lato destro dell'incubatore andrà nella condizione opposta.

4. Il numero di embrioni del giorno 3 in corso in ciascuna condizione verrà quindi registrato e fornito ai valutatori dei dati.
5. Gli embrioni non saranno esaminati o manipolati fino al quinto giorno di sviluppo come da protocollo di routine.
6. Il giorno 5 o 6 dello sviluppo dell'embrione, gli embrioni saranno valutati e il numero di blastocisti in corso sarà registrato per gli embrioni coltivati ​​in ciascuna condizione.
7. Tutti gli embrioni in corso verranno quindi sottoposti a biopsia del trofectoderma utilizzando la tecnica standardizzata secondo il protocollo di laboratorio standard indipendentemente dallo studio. Gli embrioni saranno quindi crioconservati per consentire la disponibilità dei risultati dello screening cromosomico completo e per ottimizzare la sincronia embrionale-endometriale, come da protocollo standard.
8. Ulteriori decisioni in merito al numero di embrioni euploidi da trasferire spetteranno alla paziente. I dati saranno raccolti sugli esiti della gravidanza in base alle condizioni di coltura in cui è stato esposto un embrione trasferito. Tuttavia, tutte queste informazioni saranno analizzate come risultati secondari.
9. Il test di gravidanza e il follow-up non saranno modificati.

SCHEMA DI RANDOMIZZAZIONE

La randomizzazione semplice verrà eseguita in modo indipendente presso il sito dello studio (RMANJ). Una sequenza di numeri casuali verrà generata da random.org. I numeri dispari saranno assegnati all'intervento A (2%) ossigeno e i numeri pari saranno assegnati all'intervento B (5%). Pezzi di carta contenenti la lettera dettata dalla sequenza numerica casuale verranno inseriti in una scatola di buste sigillate opache numerate in sequenza etichettate "randomizzazione dell'ossigeno".

Come notato sopra, il giorno 3, dopo aver posizionato metà degli embrioni in un piatto da 5 pozzetti e metà degli embrioni in un altro piatto da 5 pozzetti, l'embriologo separerà quei piatti sul lato sinistro e destro dell'incubatrice. L'embriologo aprirà quindi una busta sigillata opaca numerata in sequenza da questa scatola contrassegnata come "randomizzazione dell'ossigeno". Il pezzo di carta in questa busta indirizzerà l'embriologo a posizionare il piatto a 5 pozzetti sul lato sinistro dell'isoletta nell'incubatore a concentrazione di ossigeno del 2 o del 5%. Il piatto a 5 pozzetti sul lato destro dell'incubatore andrà nella condizione opposta.

Nel caso di un numero dispari di embrioni, l'embrione in più verrà sempre posizionato nel piatto sinistro a 5 pozzetti. Si prevede che i numeri si uniformeranno poiché il piatto del lato sinistro ha la stessa possibilità di randomizzazione al 2 o al 5% di concentrazione di ossigeno.