降低氧气浓度对胚胎发育影响的评估 (LO2)

在描述培养中胚胎发育的最佳环境方面取得了重大进展。 这些努力的前提是临床胚胎培养应模拟体内环境。 为此，研究人员竭尽全力重建早期胚胎所处自然环境的各个方面。 这种专注的方法导致现代体外受精 (IVF) 实验室中的胚胎培养系统发生重大变化，并最终提高了妊娠率。

一个受到严格审查的领域是孵化器氧气浓度与早期胚胎发育之间的关系。 氧气在胚胎代谢中起着核心作用。 控制其利用的机制取决于胚胎发育的阶段。 在发育的前 3 天，氧气通过被动扩散到达胚胎，其浓度梯度受氧化磷酸化过程中耗氧量的调节。 这一过程中的低效率——由于线粒体内膜的完整性受损或底物可用性的改变——可能导致有害活性氧的过量产生，这可能对细胞机器造成重大损害并最终导致胚胎停滞。

培养胚胎所接触的氧气浓度也会影响这个微妙平衡的系统，并改变胚胎的代谢健康。 从历史上看，大气中的氧气浓度（大约 20%）专门用于人类 IVF 实验室的胚胎培养。 然而，随后的多项调查发现，女性生殖道内的生理氧气浓度远低于大气水平，一直测量为 <10%。 这些观察结果导致进行了多项试验，将大气中的氧气浓度与胚胎培养中的 5% 氧气进行了比较。 这些研究表明，在大气氧气中培养的胚胎中，基因表达、蛋白质分泌以及氨基酸和碳水化合物的次优利用存在显着扰动。 在临床 IVF 研究中进行了相同的比较，并证明在 5% 氧气中培养的胚胎始终导致临床妊娠率和活产率增加。 对该主题的荟萃分析表明，在 5% O2 条件下培养胚胎时，基线活产率为 30% 的诊所有望提高 13%。

由于这些令人信服的数据，大多数现代 IVF 程序现在只在 5% 的氧气浓度下培养胚胎。 然而，有人提出胚胎在发育第 3 天后所接触的氧气浓度实际上低于 5%。 这些数据源于胚胎在体内发育第 3 天穿过子宫-输卵管交界处的想法。 多项研究表明，子宫中的氧气浓度实际上低于输卵管中的氧气浓度，约为 2%。 因此，最生理的胚胎培养系统会在第 3 天之前在 5% 的氧气中培养胚胎，然后将氧气浓度降低到 2%，直到第 5 天或第 6 天进行转移或冷冻保存。

第 3 天胚胎最佳氧浓度的变化将符合胚胎在这个发育阶段所见的代谢需求的普遍变化。 胚胎基因组的激活发生在第 3 天，这促使生物合成活性显着增加。 在此期间，胚胎的代谢行为也发生了显着变化。 胚胎以有氧糖酵解和柠檬酸循环的形式将其代谢策略从氧化磷酸化改变为基于葡萄糖的代谢。 在此过程中，称为压实，胚胎表现出大大增加的耗氧量。

女性生殖道的生理环境往往反映发育中的植入前胚胎的代谢需求。 随着胚胎在压实后和进入子宫后改变其代谢策略，子宫内氧气浓度的降低肯定有可能最好地支持胚胎发育这一阶段的能量产生机制。 在培养中重现这种环境可能会促进胚胎发育和 IVF 妊娠的长期健康。

事实上，最近的一项试点研究使用捐赠给研究的胚胎证明，胚胎发育第 3 天后在 2% 的氧气中培养时胚胎发育得到改善，而在 5% 的氧气中培养（Kaser 等人）

拟议研究的目的 本研究旨在比较压实后在 2% 氧气浓度和 5% 氧气浓度下培养的胚胎的实验室结果。 正在研究的主要结果将是第 3 天胚胎处于胚泡阶段的比例（在本文件的其余部分称为囊胚率）。

A. 学习地点：

将在两个参与的临床中心招募患者。 卵母细胞取出、胚胎学、胚胎活检和胚胎移植将在新泽西州生殖医学协会的临床设施中进行。 所有基因诊断都将在胚胎能力基金会 (FEC) 进行。

B. 研究人群：

尝试通过体外受精受孕的不孕夫妇。 将有 60 对夫妇参加研究（参见下面的样本量计算）。

研究程序 实验设计

该研究的目的是评估发育第 3 天后 2% 氧气与 5% 浓度氧气对胚胎培养的胚胎学影响。 因此，研究相关程序仅在患者的胚胎发育到第 3 天后才开始。

本研究的实验设计如下：（图1）

1. 所有护理，包括取卵、ICSI 受精和卵裂期培养（第 0、1 和 2 天），都将完全按照常规进行。
2. 我们实验室的标准方案是在第 3 天从培养箱中取出胚胎，以便 1) 进行辅助孵化和 2) 将胚胎从卵裂期培养基更换为胚泡培养基

3. 在辅助孵化时，两个 5 孔扩展培养皿将被带到 isolette，在那里将转换为扩展培养。 此 5 孔培养皿的配置如下。 将 1 mL 囊胚培养基置于 5 孔培养皿的中心孔中。 这口井仅用于在放入囊胚培养基滴之前清洗卵裂期胚胎。 外面的四个孔含有用于持续囊胚培养的小液滴。

   作为研究的一部分，一旦辅助孵化完成，所有胚胎将被放入中心孔中并混合在 1 mL 胚泡培养基中。 在低倍放大且无法进行第 3 天分级的情况下，一半胚胎将被放置在一个 5 孔培养皿的外液滴中，另一半将被放置在另一个 5 孔培养皿的外液滴中。 然后将这两个盘子分开到 isolette 的左侧和右侧。 然后，胚胎学家将从标有“氧气随机化”的盒子中打开一个按顺序编号的不透明密封信封。 此信封中的一张纸将指示胚胎学家将 isolette 左侧的 5 孔培养皿放置到 2% 或 5% 氧气浓度的培养箱中。 培养箱右侧的 5 孔培养皿将进入相反的状态。

4. 然后将记录每种情况下正在进行的第 3 天胚胎的数量，并将其提供给数据评估员。
5. 根据常规协议，在发育第 5 天之前，根本不会对胚胎进行检查或操作。
6. 在胚胎发育的第 5 天或第 6 天，将对胚胎进行评估，并记录在每种条件下培养的胚胎的持续囊胚数量。
7. 然后，所有正在进行的胚胎将根据标准实验室方案使用标准化技术进行滋养外胚层活检，而不考虑研究。 然后，胚胎将被冷冻保存，以便根据标准方案提供全面染色体筛查的结果，并优化胚胎-子宫内膜的同步性。
8. 关于要移植的整倍体胚胎数量的进一步决定将取决于患者。 将根据移植胚胎暴露的培养条件收集有关妊娠结果的数据。 但是，所有这些信息都将作为次要结果进行分析。
9. 怀孕测试和跟进不会改变。

随机模式

简单随机化将在研究地点 (RMANJ) 独立进行。 随机数序列将由 random.org 生成。 奇数将分配给 A 干预 (2%) 氧气，偶数将分配给 B 干预 (5%)。 包含由随机数字序列指示的字母的纸片将被放入一盒按顺序编号的不透明密封信封中，信封上标有“氧气随机化”。

如上所述，在第 3 天，将一半胚胎放入一个 5 孔培养皿中，将一半胚胎放入另一个 5 孔培养皿中后，胚胎学家会将这些培养皿分开放置在培养箱的左右两侧。 然后，胚胎学家将从这个标有“氧气随机化”的盒子中打开一个按顺序编号的不透明密封信封。 此信封中的一张纸将指示胚胎学家将 isolette 左侧的 5 孔培养皿放置到 2% 或 5% 氧气浓度的培养箱中。 培养箱右侧的 5 孔培养皿将进入相反的状态。

在胚胎数量为奇数的情况下，多余的胚胎将始终放置在左手 5 孔培养皿中。 由于左侧培养皿随机分配到 2% 或 5% 氧气浓度的机会均等，因此预计数字会持平。