Avaliação do Impacto da Concentração Reduzida de Oxigênio no Desenvolvimento Embrionário (LO2)

Progressos significativos foram feitos na caracterização do ambiente ideal para um embrião em desenvolvimento em cultura. Esses esforços foram baseados na premissa de que a cultura clínica de embriões deve imitar o ambiente in vivo. Para este fim, os investigadores fizeram grandes esforços para recriar todos os aspectos do cenário natural ao qual o embrião inicial é exposto. Essa abordagem focada levou a modificações significativas do sistema de cultura de embriões no moderno laboratório de fertilização in vitro (FIV) e, finalmente, a melhorias nas taxas de gravidez.

Uma área que tem sido submetida a um escrutínio significativo é a relação entre a concentração de oxigênio na incubadora e o desenvolvimento embrionário inicial. O oxigênio desempenha um papel central no metabolismo embrionário. O mecanismo que rege sua utilização depende do estágio de desenvolvimento embrionário. Durante os primeiros 3 dias de desenvolvimento, o oxigênio chega ao embrião por difusão passiva e seu gradiente de concentração é regulado pelo consumo de oxigênio durante a fosforilação oxidativa. Ineficiências neste processo - devido à integridade comprometida da membrana mitocondrial interna ou alterações na disponibilidade de substrato - podem resultar na produção excessiva de espécies reativas de oxigênio nocivas que podem causar danos significativos à maquinaria celular e, finalmente, levar à parada embrionária.

A concentração de oxigênio a que o embrião em cultura é exposto também pode afetar esse sistema delicadamente equilibrado e alterar a saúde metabólica de um embrião. Historicamente, a concentração de oxigênio atmosférico (aproximadamente 20%) foi utilizada exclusivamente em laboratórios de FIV humana para cultura de embriões. No entanto, várias investigações subsequentes descobriram que a concentração fisiológica de oxigênio no trato reprodutivo feminino está bem abaixo dos níveis atmosféricos, sendo consistentemente medida em <10%. Essas observações levaram a vários testes comparando as concentrações de oxigênio atmosférico a 5% de oxigênio na cultura de embriões. Esses estudos demonstraram perturbações significativas na expressão gênica, secreção de proteínas e utilização subótima de aminoácidos e carboidratos em embriões cultivados em oxigênio atmosférico. As mesmas comparações foram feitas em estudos clínicos de fertilização in vitro e demonstraram que os embriões cultivados em 5% de oxigênio resultaram consistentemente em um aumento na taxa de gravidez clínica e na taxa de nascidos vivos. Uma meta-análise deste tópico sugeriu que uma clínica com uma taxa de nascidos vivos de 30% poderia esperar uma melhora de até 13% ao cultivar embriões a 5% de O2.

Como resultado desses dados convincentes, a maioria dos programas modernos de fertilização in vitro agora cultiva exclusivamente embriões com concentração de oxigênio de 5%. No entanto, alguns propuseram que a concentração de oxigênio à qual o embrião é exposto após o terceiro dia de desenvolvimento é, na verdade, inferior a 5%. Esses dados se originam da ideia de que o embrião cruza a junção útero-tubária no dia 3 do desenvolvimento in vivo. Vários estudos demonstraram que a concentração de oxigênio no útero é realmente menor do que na trompa de Falópio em aproximadamente 2%. Assim, o sistema de cultura de embriões mais fisiológico seria cultivar embriões em 5% de oxigênio até o dia 3 e depois diminuir a concentração de oxigênio para 2% até a transferência ou criopreservação no dia 5 ou 6.

Uma mudança na concentração ideal de oxigênio para um embrião no dia 3 se ajustaria a uma mudança geral nas necessidades metabólicas de embriões observadas nesse estágio de desenvolvimento. A ativação do genoma embrionário ocorre no dia 3, o que leva a um aumento significativo na atividade biossintética. O comportamento metabólico dos embriões também muda substancialmente durante esse período. O embrião muda sua estratégia metabólica da fosforilação oxidativa para o metabolismo baseado em glicose na forma da glicólise aeróbica e do ciclo do ácido cítrico. Durante este processo, denominado compactação, os embriões exibem um consumo de oxigênio muito maior.

O ambiente fisiológico do trato reprodutivo feminino tende a espelhar as necessidades metabólicas do desenvolvimento do embrião pré-implantação. Como o embrião muda sua estratégia metabólica após a compactação e ao entrar no útero, certamente é possível que uma concentração reduzida de oxigênio no útero possa apoiar melhor os mecanismos de produção de energia desse estágio do desenvolvimento embrionário. A recapitulação desse ambiente na cultura pode melhorar o desenvolvimento embrionário e a saúde a longo prazo das gestações resultantes da fertilização in vitro.

De fato, um estudo piloto recente, usando embriões doados para pesquisa, demonstrou um melhor desenvolvimento embrionário quando os embriões foram cultivados em 2% de oxigênio após o terceiro dia de desenvolvimento, em comparação com 5% (Kaser et al.)

Objetivo do estudo proposto Este estudo visa comparar os resultados laboratoriais de embriões cultivados em concentração de oxigênio de 2% e concentração de oxigênio de 5% após a compactação. O resultado primário em estudo será a proporção de embriões de dia 3 que estão em andamento no estágio de blastocisto (conhecido no restante deste documento como taxa de blastulação).

A. Local do Estudo:

Os pacientes serão recrutados em ambos os centros clínicos participantes. A coleta de oócitos, a embriologia, a biópsia de embriões e a transferência de embriões ocorrerão nas instalações clínicas da Reproductive Medicine Associates de Nova Jersey. Todos os diagnósticos genéticos ocorrerão na Foundation for Embryonic Competence (FEC).

B. População do estudo:

Casais inférteis que tentam engravidar por fertilização in vitro. 60 casais serão incluídos no estudo (veja o cálculo do tamanho da amostra abaixo).

PROCEDIMENTOS DO ESTUDO Desenho Experimental

O objetivo do estudo é avaliar o impacto embriológico de 2% de oxigênio versus concentrações de 5% na cultura de embriões após o terceiro dia de desenvolvimento. Como tal, os procedimentos relacionados ao estudo começam somente após os embriões de um paciente atingirem o terceiro dia de desenvolvimento.

O desenho experimental para este estudo é o seguinte: (Figura 1)

1. Todos os cuidados, incluindo coleta de ovócitos, fertilização por ICSI e cultura do estágio de clivagem (dias 0, 1 e 2) serão totalmente de rotina.
2. É protocolo padrão em nosso laboratório remover os embriões da incubadora no dia 3 para 1) realizar a incubação assistida e 2) mudar os embriões do meio do estágio de clivagem para o meio do blastocisto

3. No momento da incubação assistida, dois pratos de cultura estendida de 5 poços serão levados para o isolamento, onde ocorrerá a mudança para cultura estendida. A configuração desta placa de 5 poços é a seguinte. Um mL de meio de blastocisto é colocado no centro bem do prato de 5 poços. Este poço é usado apenas para lavagem de embriões em estágio de clivagem antes da colocação em gotas de meio de blastocisto. Os quatro poços externos contêm pequenas gotas para cultura contínua de blastocistos.

   Como parte do estudo, uma vez concluída a eclosão assistida, todos os embriões serão colocados no poço central e misturados em 1 mL de meio de blastocisto. Em ampliação de baixa potência e sem capacidade de realizar a classificação do dia 3, metade dos embriões será colocada nas gotas externas em uma placa de 5 poços e metade será colocada nas gotas externas da outra placa de 5 poços. Esses dois pratos serão então separados para o lado esquerdo e direito da isolette. Um embriologista, então, abrirá um envelope selado opaco numerado sequencialmente da caixa marcada como "randomização de oxigênio". O pedaço de papel neste envelope instruirá o embriologista a colocar a placa de 5 poços no lado esquerdo da isoleta na incubadora de concentração de oxigênio de 2 ou 5%. A placa de 5 poços no lado direito da incubadora irá para a condição oposta.

4. O número de embriões de dia 3 em andamento em cada condição será então registrado e dado aos avaliadores de dados.
5. Os embriões não serão examinados ou manipulados até o 5º dia de desenvolvimento de acordo com o protocolo de rotina.
6. No dia 5 ou 6 do desenvolvimento do embrião, os embriões serão avaliados e o número de blastocistos em curso será registrado para embriões cultivados em cada condição.
7. Todos os embriões em andamento serão então submetidos a uma biópsia de trofectoderma usando a técnica padronizada de acordo com o protocolo de laboratório padrão, independentemente do estudo. Os embriões serão então criopreservados para permitir a disponibilização dos resultados da triagem cromossômica abrangente e para otimizar a sincronia embrionário-endometrial, de acordo com o protocolo padrão.
8. Outras decisões sobre o número de embriões euplóides a serem transferidos caberão ao paciente. Os dados serão coletados sobre os resultados da gravidez de acordo com as condições de cultura a que um embrião transferido foi exposto. No entanto, todas essas informações serão analisadas como desfechos secundários.
9. O teste de gravidez e o acompanhamento não serão alterados.

ESQUEMA DE RANDOMIZAÇÃO

A randomização simples será realizada de forma independente no local do estudo (RMANJ). Uma sequência de números aleatórios será gerada por random.org. Números ímpares serão atribuídos à intervenção A (2%) oxigênio e números pares serão atribuídos à intervenção B (5%). Pedaços de papel contendo a letra ditada pela sequência de números aleatórios serão colocados em uma caixa de envelopes selados opacos, numerados sequencialmente, rotulados como "randomização de oxigênio".

Conforme observado acima, no dia 3, após colocar metade dos embriões em uma placa de 5 poços e metade dos embriões em outra placa de 5 poços, o embriologista separará essas placas nos lados esquerdo e direito da incubadora. O embriologista, então, abrirá um envelope selado, opaco e numerado sequencialmente desta caixa marcada como "randomização de oxigênio". O pedaço de papel neste envelope instruirá o embriologista a colocar a placa de 5 poços no lado esquerdo da isoleta na incubadora de concentração de oxigênio de 2 ou 5%. A placa de 5 poços no lado direito da incubadora irá para a condição oposta.

No caso de um número ímpar de embriões, o embrião extra será sempre colocado na placa de 5 poços para a esquerda. Prevê-se que os números se igualem, pois o prato do lado esquerdo tem uma chance igual de randomização para 2 ou 5% de concentração de oxigênio.