자궁내막증이 있는 여성의 자궁내막 조직에서 M1 및 M2 대식세포의 단계에 따른 평가

배경 및 근거: 자궁내막증은 자궁강 외부의 기능적 자궁내막 조직, 샘 및 간질의 이소성 존재 및 성장으로 정의되는 에스트로겐 의존성 질병입니다(Kavoussi et al, 2016). 자궁내막증의 발병기전은 여전히 ​​논란의 여지가 있습니다. 면역, 호르몬, 유전, 후생유전학적 요인이 모두 관련될 수 있으며 이를 설명하기 위해 여러 이론이 제안되었습니다.

이 질병은 가임기 여성의 2~10%와 불임 여성의 50%에 영향을 미치며(Dunselman et al, 2014) 골반 통증(Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), 비정상 출혈, 불임/불임을 유발할 수 있습니다. 결과적으로 중요한 심리적 문제가 발생합니다(Laganà et al, 2015). 자궁내막증은 자궁내막 임플란트, 플라크, 자궁내막종 및/또는 유착의 수, 크기, 표면 및/또는 깊은 위치에 따라 분류됩니다. 자궁내막증의 가장 많이 사용되는 분류는 American Society for Reproductive Medicine(Rock JA, 1995)에 의해 개발되었지만, 심부 침윤성 자궁내막증(Haas et al, 2011) 또는 자궁내막증과 불임의 상관 관계(Adamson et al, 2010).

널리 입증된 바와 같이(Donnez et al, 2016), 중등도/중증 자궁내막증 관련 불임은 기계적 요인, 즉 규칙적인 골반 해부학의 왜곡/전복에 기인한다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. 반대로, 경미한/경미한 자궁내막증과 관련된 불임/난임 뒤에 있는 요인은 덜 명확합니다. 그럼에도 불구하고 현재까지 가설화된 기전 중 어느 것도 자궁내막증과 관련된 불임을 완전히 설명하지 못했지만, 이러한 질병은 유전적 및 후생유전적 변형을 포함한 여러 요인에 의해 발생할 가능성이 있습니다(Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

축적된 증거(Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016)는 자궁내막증에 의해 영향을 받은 여성의 복막 미세 환경이 상주 대식세포의 관여와 말초 단핵 세포의 유인 및 모집과 함께 여러 국소 염증-복구 현상을 겪는다는 것을 시사합니다. 세포(단핵구 및 림프구)를 혈액에서 복막강으로: 자궁내막증 동안 사이토카인 처리 세포 증식(Pizzo et al, 2002) 및 세포자멸사의 조절장애(Sturlese et al, 2011; Salmeri 외, 2015).

단핵구는 감염 또는 염증 부위로 이동하고, 대식세포에서 분화하고, 항원 제시 세포(APC)로 작용하기 때문에 적응 면역 동안 중요한 역할을 합니다.

Messina(JAMA, 1968)에서 Elie Metchnikoff가 식균 작용을 처음으로 확인한 이후 불가사리 유충에 대한 실험을 거쳐 많은 단계를 거쳐 대식 세포의 역할과는 별도로 대식 세포에 대한 광범위한 개요를 얻을 수 있었습니다.

주변 미세 환경은 일시적이고 가역적인 분극화를 향한 대식세포 가소성을 다룰 수 있습니다. 이러한 양극화된 표현형은 염증 유발 또는 항염증 상태를 반영하며 시간이 지남에 따라 변할 수 있습니다. 이들은 기능적으로 두 가지 주요 개체군으로 분류될 수 있습니다: "고전적으로 활성화된" 대식세포(M1) 및 "대체적으로 활성화된" 대식세포(M2)(Sica & Mantovani, 2012). M1과 M2가 대식세포 활성화의 전체 스펙트럼의 두 말단을 나타내는 것으로 널리 받아들여지고 있지만(Liu et al, 2014), 최근 데이터(Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) 다음과 같이 이 두 모집단을 특성화할 수 있습니다.

• M1 대식세포: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 대식세포: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

연구 인구: 조사관은 복강경 수술을 받을 조직학적으로 확인된 자궁내막증(사례) 및 난소 기능성 낭종(대조군)의 영향을 받는 환자를 선택할 것입니다. 자궁내막증에 대한 개정된 미국 생식 의학 학회 분류(Rock JA, 1995)에 따라 자궁내막증 환자는 자궁내막증의 최소 단계, 경도 단계, 중등도 단계 및 중증 단계의 4개 그룹으로 나뉩니다.

모든 복강경 수술은 월경 주기의 증식 단계에서 수행됩니다. 조사관은 다른 골반 장애, 만성 순환기 질환, 자가 면역 또는 신생물 질환의 영향을 받고 지난 6개월 동안 항염증제 또는 호르몬제 또는 면역 조절제를 복용한 여성을 연구에서 제외할 것입니다.

조직 샘플 준비 및 대식세포 특성화: 조직 절편(경우의 경우 자궁내막 조직, 대조군의 경우 난소 기능성 낭종)을 다지고 최종 농도 3.4mg/ml 판크레아틴, 0.1mg/ml 히알루로니다제 및 1.6mg/ml를 함유하는 효소 칵테일에서 배양합니다. 37°C에서 2시간 동안 2 mg/ml D-포도당을 함유하는 Hank's Buffered Saline Solution(HBSS)의 콜라게나제 I. 분해 후, 세포는 250μm 메쉬 스크린을 통해 여과하여 분산되고 HBSS로 세척됩니다. 유세포 분석을 위해 조직 세포를 염색하고 고정합니다. 대식세포 분리 전에 죽은 세포 제거 키트를 사용하여 배양에서 죽은 세포를 제거합니다. 세포 생존력은 트리판 블루 배제에 의해 평가될 것이다.

대식세포 마커의 표면 발현을 평가하기 위해 조직 샘플은 M1을 식별하기 위해 CD14, CD68, CCR7 및 CD80에 대한 형광색소 결합 단일클론 항체로 유세포 분석을 위해 염색되는 반면 CD14, CD68, CD163 및 CD206에 대한 형광색소 결합 단일클론 항체는 식별합니다. M2.

통계 분석: 연속 변수에 대한 정규 분포의 가정은 적합도에 대한 Kolmogorov-Smirnov 테스트에 의해 테스트됩니다. 모든 추론 분석은 비모수 통계 테스트를 사용하여 수행됩니다. 그룹 간의 비정규 분포 변수는 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교됩니다. 통계적 유의성의 범위는 P < .05입니다. 또한 조사관은 데이터를 분석하기 위해 대조군 또는 각 단계에 대해 사후 다중 비교 테스트를 사용할 것입니다.