Utvärdering av M1- och M2-makrofager i endometriotisk vävnad hos kvinnor som drabbats av endometrios i olika stadier.

Bakgrund och motivering: Endometrios är en östrogenberoende sjukdom som definieras av ektopisk närvaro och tillväxt av funktionell endometrievävnad, körtlar och stroma, utanför livmoderhålan (Kavoussi et al, 2016). Etiopatogenesen av endometrios är fortfarande kontroversiell: immuna, hormonella, genetiska och epigenetiska faktorer kan alla vara inblandade, och flera teorier har föreslagits för att förklara det.

Sjukdomen drabbar 2-10 % av kvinnor i fertil ålder och 50 % av de infertila (Dunselman et al, 2014) och kan orsaka bäckensmärta (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), onormal blödning, infertilitet/sterilitet och följaktligen viktiga psykologiska problem (Laganà et al, 2015). Endometrios klassificeras beroende på antalet, storleken och ytliga och/eller djupa placeringen av endometrieimplantat, plack, endometriom och/eller adhesioner. Den mest använda klassificeringen av endometrios har utvecklats av American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), även om annan klassificering kan användas för djup infiltrerande endometrios (Haas et al, 2011) eller för att korrelera endometrios och infertilitet (Adamson et al, 2010).

Som allmänt bevisats (Donnez et al, 2016) är det allmänt accepterat att måttlig/svår endometriosrelaterad sterilitet beror på mekaniska faktorer, nämligen förvrängning/subversion av den vanliga bäckenanatomin. Tvärtom är faktorerna bakom infertilitet/subfertilitet relaterad till minimal/lindrig endometrios mindre tydliga. Ändå har hittills ingen av de hypotetiska mekanismerna förklarat uttömmande infertiliteten relaterad till endometrios, medan det är möjligt att sådan sjukdom orsakas av flera faktorer totalt, inklusive genetiska och epigenetiska modifieringar (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Ackumulerande bevis (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) tyder på att den peritoneala mikromiljön hos kvinnor som drabbats av endometrios genomgår ett antal lokala inflammatoriskt-reparativa fenomen, med inblandning av inhemska makrofager, och attraktion och rekrytering av perifera mononukleära celler (monocyter och lymfocyter) från blodet in i bukhålan: under endometrios sker en nedbrytning av endometrial och peritoneal homeostas orsakad av cytokin-adresserad cellproliferation (Pizzo et al, 2002) och dysreglering av apoptos (Sturlese et al, 2011; Salmeri11, 2011). et al, 2015).

Monocyter spelar en nyckelroll under adaptiv immunitet, eftersom de migrerar till platser för infektion eller inflammation, differentierar i makrofager och fungerar som antigenpresenterande celler (APC).

Sedan deras första identifiering av fagocytos av Elie Metchnikoff i Messina (JAMA, 1968), efter att ha experimenterat på sjöstjärnans larver, har många steg framåt gjort det möjligt för oss att ha en bred överblick över makrofager förutom deras roll som fagocytiska celler.

Den omgivande mikromiljön kan adressera makrofagens plasticitet mot en övergående och reversibel polarisering. Dessa polariserade fenotyper återspeglar den proinflammatoriska eller antiinflammatoriska statusen och kan förändras över tiden. De skulle kunna klassificeras funktionellt i två huvudpopulationer: "klassiskt aktiverade" makrofager (M1) och "alternativt aktiverade" makrofager (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Även om det är allmänt accepterat att M1 och M2 representerar två terminaler av hela spektrumet av makrofagaktivering (Liu et al, 2014), nyare data (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) får karakterisera dessa två populationer enligt följande:

• M1-makrofager: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2-makrofager: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Studiepopulation: Utredarna kommer att välja ut patienter som drabbats av histologiskt bekräftad endometrios (fall) och av ovariefunktionella cystor (kontroller), som kommer att genomgå laparoskopisk kirurgi. I enlighet med den reviderade klassificeringen av American Society for Reproductive Medicine för endometrios (Rock JA, 1995), kommer endometriotiska patienter att delas in i 4 grupper: minimala, milda, måttliga och svåra stadier av endometrios.

Alla laparoskopiska procedurer kommer att utföras under den proliferativa fasen av menstruationscykeln. Utredarna kommer från studien att utesluta kvinnor som drabbats av andra bäckensjukdomar, kronisk cirkulationssjukdom, autoimmun eller neoplastisk sjukdom och som tagit någon antiinflammatorisk eller hormonell eller immunmodulerande medicin under de föregående 6 månaderna.

Beredning av vävnadsprov och makrofagkarakterisering: Vävnadssnitt (endometriotiska vävnader för fall, funktionella cystor på äggstockarna för kontroller) kommer att hackas och inkuberas i en enzymcocktail innehållande slutkoncentrationer på 3,4 mg/ml pankreatin, 0,1 mg/ml hyaluronidas och 1,6 mg/ml kollagenas I i Hanks buffrade saltlösning (HBSS) innehållande 2 mg/ml D-glukos vid 37°C under 2 timmar. Efter digestion kommer cellerna att spridas genom silning genom en 250 μm mesh skärm och tvättas med HBSS. Vävnadsceller kommer att färgas och fixeras för flödescytometrisk analys. Före makrofagisolering kommer döda celler att tas bort från kulturen med hjälp av kit för borttagning av döda celler. Cellviabilitet kommer att bedömas genom uteslutning av trypanblått.

För att bedöma ytuttryck av makrofagmarkörer kommer vävnadsprover att färgas för flödescytometri med fluorokrom-konjugerade monoklonala antikroppar mot CD14, CD68, CCR7 och CD80 för att identifiera M1, medan fluorokrom-konjugerade monoklonala antikroppar mot CD14, CD68, CD163 för att identifiera och CD200 M2.

Statistisk analys: Antagandet om normalfördelning för kontinuerliga variabler kommer att testas med Kolmogorov-Smirnovs test för god passform. Alla inferentiella analyser kommer att utföras med hjälp av icke-parametriska statistiska tester. Icke-normalfördelade variabler mellan grupperna kommer att jämföras med Kruskal-Wallis-testet. Intervallet för statistisk signifikans kommer att vara P < 0,05. Dessutom kommer utredarna att använda post hoc multipla jämförelsetester antingen mot kontroller eller mot varje steg för att analysera data.