Bewertung von M1- und M2-Makrophagen im Endometriosegewebe von Frauen, die in verschiedenen Stadien von Endometriose betroffen sind.

Hintergrund und Begründung: Endometriose ist eine östrogenabhängige Erkrankung, die durch das ektopische Vorhandensein und Wachstum von funktionellem Endometriumgewebe, Drüsen und Stroma außerhalb der Gebärmutterhöhle definiert ist (Kavoussi et al., 2016). Die Ätiopathogenese der Endometriose bleibt nach wie vor umstritten: Immun-, hormonelle, genetische und epigenetische Faktoren können alle beteiligt sein, und mehrere Theorien wurden vorgeschlagen, um dies zu erklären.

Die Krankheit betrifft 2-10 % der Frauen im gebärfähigen Alter und 50 % der unfruchtbaren Frauen (Dunselman et al., 2014) und kann Beckenschmerzen (Triolo et al., 2013; Butticè et al., 2013), anormale Blutungen, Unfruchtbarkeit/Sterilität verursachen und folglich wichtige psychologische Probleme (Laganà et al, 2015). Endometriose wird in Abhängigkeit von der Anzahl, Größe und oberflächlichen und/oder tiefen Lage von Endometriumimplantaten, Plaques, Endometriomen und/oder Adhäsionen klassifiziert. Die am häufigsten verwendete Klassifikation der Endometriose wurde von der American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995) entwickelt, obwohl andere Klassifikationen für tief infiltrierende Endometriose (Haas et al., 2011) oder zur Korrelation von Endometriose und Unfruchtbarkeit verwendet werden können (Adamson et al., 2010).

Wie weithin belegt (Donnez et al., 2016), ist es allgemein anerkannt, dass eine mittelschwere/schwere Endometriose-bedingte Sterilität auf mechanische Faktoren zurückzuführen ist, nämlich auf die Verzerrung/Subversion der regulären Beckenanatomie. Im Gegensatz dazu sind die Faktoren hinter Unfruchtbarkeit/Subfertilität im Zusammenhang mit minimaler/leichter Endometriose weniger klar. Dennoch hat bis heute keiner der hypothetischen Mechanismen die Unfruchtbarkeit im Zusammenhang mit Endometriose erschöpfend erklärt, obwohl es möglich ist, dass eine solche Krankheit insgesamt durch mehrere Faktoren verursacht wird, einschließlich genetischer und epigenetischer Veränderungen (Sofo et al., 2015; Maniglio et al., 2016).

Immer mehr Beweise (Laganà et al., 2013; Laganà et al., 2016) deuten darauf hin, dass die peritoneale Mikroumgebung von Frauen, die von Endometriose betroffen sind, einer Reihe lokaler entzündlich-reparativer Phänomene unterliegt, an denen residente Makrophagen beteiligt sind und periphere mononukleäre Zellen angezogen und rekrutiert werden Zellen (Monozyten und Lymphozyten) aus dem Blut in die Bauchhöhle: Während der Endometriose kommt es zu einem Zusammenbruch der endometrialen und peritonealen Homöostase, verursacht durch Zytokin-adressierte Zellproliferation (Pizzo et al., 2002) und Dysregulation der Apoptose (Sturlese et al., 2011; Salmeri et al., 2015).

Monozyten spielen eine Schlüsselrolle während der adaptiven Immunität, da sie an Infektions- oder Entzündungsherde wandern, sich in Makrophagen differenzieren und als antigenpräsentierende Zellen (APCs) fungieren.

Seit ihrer ersten Identifizierung der Phagozytose durch Elie Metchnikoff in Messina (JAMA, 1968), nach Experimenten mit Seesternlarven, haben uns viele Fortschritte ermöglicht, einen breiten Überblick über Makrophagen zu gewinnen, abgesehen von ihrer Rolle als Fresszellen.

Die umgebende Mikroumgebung kann die Makrophagen-Plastizität in Richtung einer vorübergehenden und reversiblen Polarisierung ansprechen. Diese polarisierten Phänotypen spiegeln den entzündungsfördernden oder entzündungshemmenden Status wider und können sich im Laufe der Zeit ändern. Sie konnten funktionell in zwei Hauptpopulationen eingeteilt werden: „klassisch aktivierte“ Makrophagen (M1) und „alternativ aktivierte“ Makrophagen (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Obwohl weithin anerkannt ist, dass M1 und M2 zwei Terminals des gesamten Spektrums der Makrophagenaktivierung darstellen (Liu et al., 2014), neuere Daten (Locati et al., 2013; Mantovani et al., 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) erlaubt, diese beiden Populationen wie folgt zu charakterisieren:

• M1 Makrophagen: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 Makrophagen: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Studienpopulation: Die Prüfärzte werden Patientinnen auswählen, die von histologisch bestätigter Endometriose (Fälle) und von funktionellen Ovarialzysten (Kontrollen) betroffen sind und sich einer laparoskopischen Operation unterziehen. In Übereinstimmung mit der überarbeiteten Klassifikation der American Society for Reproductive Medicine für Endometriose (Rock JA, 1995) werden Endometriosepatientinnen in 4 Gruppen eingeteilt: minimale, leichte, mittelschwere und schwere Stadien der Endometriose.

Alle laparoskopischen Eingriffe werden während der proliferativen Phase des Menstruationszyklus durchgeführt. Die Prüfärzte werden Frauen von der Studie ausschließen, die an anderen Beckenerkrankungen, chronischen Kreislauferkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder neoplastischen Erkrankungen leiden und die in den vorangegangenen 6 Monaten entzündungshemmende oder hormonelle oder immunmodulatorische Medikamente eingenommen haben.

Gewebeprobenvorbereitung und Makrophagencharakterisierung: Gewebeschnitte (endometriotische Gewebe für Fälle, Ovarialfunktionszysten für Kontrollen) werden zerkleinert und in einem Enzymcocktail mit Endkonzentrationen von 3,4 mg/ml Pankreatin, 0,1 mg/ml Hyaluronidase und 1,6 mg/ml inkubiert Kollagenase I in Hank's Buffered Saline Solution (HBSS), enthaltend 2 mg/ml D-Glucose, bei 37°C für 2 Stunden. Nach dem Verdau werden die Zellen dispergiert, indem sie durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 250 μm gesiebt und mit HBSS gewaschen werden. Gewebezellen werden für die durchflusszytometrische Analyse gefärbt und fixiert. Vor der Isolierung der Makrophagen werden tote Zellen mit dem Kit zur Entfernung toter Zellen aus der Kultur entfernt. Die Zelllebensfähigkeit wird durch Trypanblau-Ausschluss bewertet.

Um die Oberflächenexpression von Makrophagenmarkern zu beurteilen, werden Gewebeproben für die Durchflusszytometrie mit Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen CD14, CD68, CCR7 und CD80 gefärbt, um M1 zu identifizieren, während Fluorochrom-konjugierte monoklonale Antikörper gegen CD14, CD68, CD163 und CD206 identifiziert werden M2.

Statistische Analyse: Die Annahme einer Normalverteilung für kontinuierliche Variablen wird durch den Kolmogorov-Smirnov-Test auf Anpassungsgüte getestet. Alle Inferenzanalysen werden mit nichtparametrischen statistischen Tests durchgeführt. Nichtnormalverteilte Variablen zwischen den Gruppen werden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests verglichen. Der Bereich der statistischen Signifikanz ist P < 0,05. Darüber hinaus werden die Ermittler Post-hoc-Mehrfachvergleichstests entweder mit Kontrollen oder mit jeder Stufe verwenden, um Daten zu analysieren.