Evaluatie van M1- en M2-macrofagen in endometrioseweefsel van vrouwen die getroffen zijn door endometriose in verschillende stadia.

Achtergrond en grondgedachte: Endometriose is een oestrogeenafhankelijke ziekte die wordt gedefinieerd door de ectopische aanwezigheid en groei van functioneel endometriumweefsel, klieren en stroma, buiten de baarmoederholte (Kavoussi et al, 2016). De etiopathogenese van endometriose blijft nog steeds controversieel: immuun-, hormonale, genetische en epigenetische factoren kunnen allemaal een rol spelen, en er zijn verschillende theorieën voorgesteld om dit te verklaren.

De ziekte treft 2-10% van de vrouwen in de vruchtbare leeftijd en 50% van de vrouwen die onvruchtbaar zijn (Dunselman et al, 2014) en kan bekkenpijn veroorzaken (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), abnormale bloedingen, onvruchtbaarheid/steriliteit en bijgevolg belangrijke psychologische problemen (Laganà et al, 2015). Endometriose wordt geclassificeerd afhankelijk van het aantal, de grootte en de oppervlakkige en/of diepe locatie van endometriumimplantaten, plaques, endometriomen en/of verklevingen. De meest gebruikte classificatie van endometriose is ontwikkeld door de American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), hoewel een andere classificatie kan worden gebruikt voor diep infiltrerende endometriose (Haas et al, 2011) of om endometriose en onvruchtbaarheid te correleren (Adamson et al, 2010).

Zoals algemeen is aangetoond (Donnez et al, 2016), wordt algemeen aanvaard dat matige/ernstige aan endometriose gerelateerde steriliteit te wijten is aan mechanische factoren, namelijk aan de vervorming/ondermijning van de reguliere bekkenanatomie. Integendeel, de factoren achter onvruchtbaarheid/subfertiliteit gerelateerd aan minimale/milde endometriose zijn minder duidelijk. Desalniettemin heeft tot op heden geen van de veronderstelde mechanismen de onvruchtbaarheid in verband met endometriose uitputtend verklaard, terwijl het mogelijk is dat een dergelijke ziekte wordt veroorzaakt door meerdere factoren, waaronder genetische en epigenetische modificaties (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Accumulerend bewijs (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) suggereert dat de peritoneale micro-omgeving van vrouwen die getroffen zijn door endometriose een aantal lokale inflammatoire-reparatieve verschijnselen ondergaat, met de betrokkenheid van residente macrofagen en de aantrekking en rekrutering van perifere mononucleaire cellen (monocyten en lymfocyten) vanuit het bloed in de peritoneale holte: tijdens endometriose treedt een afbraak op in endometriale en peritoneale homeostase veroorzaakt door cytokine-geadresseerde celproliferatie (Pizzo et al, 2002) en ontregeling van apoptose (Sturlese et al, 2011; Salmeri e.a., 2015).

Monocyten spelen een sleutelrol tijdens adaptieve immuniteit, aangezien ze migreren op plaatsen van infectie of ontsteking, differentiëren in macrofagen en fungeren als antigene presenterende cellen (APC's).

Sinds hun eerste identificatie van fagocytose door Elie Metchnikoff in Messina (JAMA, 1968), na te hebben geëxperimenteerd met de larven van zeesterren, hebben we vele stappen vooruit gezet om een ​​breed overzicht te krijgen van macrofagen, afgezien van hun rol als fagocytische cellen.

De omringende micro-omgeving kan de plasticiteit van macrofagen richten op een voorbijgaande en omkeerbare polarisatie. Deze gepolariseerde fenotypen weerspiegelen de pro-inflammatoire of ontstekingsremmende status en kunnen in de loop van de tijd veranderen. Ze kunnen functioneel worden ingedeeld in twee hoofdpopulaties: "klassiek geactiveerde" macrofagen (M1) en "alternatief geactiveerde" macrofagen (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Hoewel algemeen wordt aanvaard dat M1 en M2 twee terminals vertegenwoordigen van het volledige spectrum van macrofaagactivering (Liu et al, 2014), recente gegevens (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) mogen deze twee populaties als volgt karakteriseren:

• M1 macrofagen: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 macrofagen: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Studiepopulatie: De onderzoekers zullen patiënten selecteren die getroffen zijn door histologisch bevestigde endometriose (gevallen) en door ovariële functionele cysten (controles), die laparoscopische chirurgie zullen ondergaan. In overeenstemming met de herziene classificatie van de American Society for Reproductive Medicine voor endometriose (Rock JA, 1995), worden endometriosepatiënten verdeeld in 4 groepen: minimale, milde, matige en ernstige stadia van endometriose.

Alle laparoscopische procedures worden uitgevoerd tijdens de proliferatieve fase van de menstruatiecyclus. De onderzoekers zullen vrouwen uitsluiten van de studie die getroffen zijn door andere bekkenaandoeningen, chronische bloedsomloop, auto-immuunziekte of neoplastische ziekte en die in de voorgaande 6 maanden ontstekingsremmende of hormonale of immunomodulerende medicatie hebben gebruikt.

Voorbereiding van weefselmonsters en karakterisering van macrofagen: Weefselsecties (endometriose weefsels voor gevallen, ovariële functionele cysten voor controles) zullen worden gehakt en geïncubeerd in een enzymcocktail met eindconcentraties van 3,4 mg/ml pancreatine, 0,1 mg/ml hyaluronidase en 1,6 mg/ml collagenase I in Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) met 2 mg/ml D-glucose bij 37°C gedurende 2 uur. Na digestie worden de cellen gedispergeerd door ze door een zeef met een maaswijdte van 250 μm te spannen en met HBSS te wassen. Weefselcellen worden gekleurd en gefixeerd voor flowcytometrische analyse. Voorafgaand aan de isolatie van macrofagen worden dode cellen uit de kweek verwijderd met behulp van de kit voor het verwijderen van dode cellen. De levensvatbaarheid van de cellen zal worden beoordeeld door uitsluiting van trypaanblauw.

Om oppervlakte-expressie van macrofaagmarkers te beoordelen, zullen weefselmonsters worden gekleurd voor flowcytometrie met fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen CD14, CD68, CCR7 en CD80 om M1 te identificeren, terwijl fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen CD14, CD68, CD163 en CD206 om te identificeren M2.

Statistische analyse: de aanname van normale verdeling voor continue variabelen zal worden getest door de Kolmogorov-Smirnov-test op geschiktheid. Alle inferentiële analyses zullen worden uitgevoerd met behulp van niet-parametrische statistische tests. Niet-normaal verdeelde variabelen tussen de groepen zullen worden vergeleken met behulp van de Kruskal-Wallis-test. Het bereik van statistische significantie zal P < .05 zijn. Bovendien zullen de onderzoekers post-hoc meervoudige vergelijkingstests gebruiken, hetzij versus controles, hetzij versus elke fase om gegevens te analyseren.