Avaliação dos Macrófagos M1 e M2 no Tecido Endometriótico de Mulheres Acometidas por Endometriose em Diferentes Estágios.

Antecedentes e justificativa: A endometriose é uma doença dependente de estrogênio definida pela presença ectópica e crescimento de tecido endometrial funcional, glândulas e estroma, fora da cavidade uterina (Kavoussi et al, 2016). A etiopatogenia da endometriose ainda permanece controversa: fatores imunológicos, hormonais, genéticos e epigenéticos podem estar envolvidos, e várias teorias foram propostas para explicá-la.

A doença afeta 2-10% das mulheres em idade reprodutiva e 50% das inférteis (Dunselman et al, 2014) e pode causar dor pélvica (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), sangramento anormal, infertilidade/esterilidade e, consequentemente, problemas psicológicos importantes (Laganà et al, 2015). A endometriose é classificada de acordo com o número, tamanho e localização superficial e/ou profunda de implantes endometriais, placas, endometriomas e/ou aderências. A classificação de endometriose mais utilizada foi desenvolvida pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (Rock JA, 1995), embora outras classificações possam ser usadas para endometriose infiltrativa profunda (Haas et al, 2011) ou para correlacionar endometriose e infertilidade (Adamson et al, 2010).

Conforme amplamente evidenciado (Donnez et al, 2016), é geralmente aceite que a esterilidade relacionada com a endometriose moderada/grave se deve a fatores mecânicos, nomeadamente à distorção/subversão da anatomia pélvica regular. Pelo contrário, os fatores por trás da infertilidade/subfertilidade relacionados à endometriose mínima/leve são menos claros. No entanto, até o momento, nenhum dos mecanismos hipotéticos explicou exaustivamente a infertilidade relacionada à endometriose, embora seja possível que essa doença seja causada por múltiplos fatores, incluindo modificações genéticas e epigenéticas (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Evidências acumuladas (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) sugerem que o microambiente peritoneal de mulheres afetadas pela endometriose sofre uma série de fenômenos inflamatórios reparadores locais, com o envolvimento de macrófagos residentes e a atração e recrutamento de células mononucleares periféricas células (monócitos e linfócitos) do sangue para a cavidade peritoneal: durante a endometriose ocorre uma quebra na homeostase endometrial e peritoneal causada pela proliferação celular endereçada por citocinas (Pizzo et al, 2002) e desregulação da apoptose (Sturlese et al, 2011; Salmeri e outros, 2015).

Os monócitos desempenham um papel fundamental durante a imunidade adaptativa, uma vez que migram em locais de infecção ou inflamação, diferenciam-se em macrófagos e atuam como células apresentadoras de antígenos (APCs).

Desde a primeira identificação da fagocitose por Elie Metchnikoff em Messina (JAMA, 1968), após experimentos com larvas de estrelas do mar, muitos avanços nos permitiram ter uma visão ampla dos macrófagos, além de seu papel como células fagocitárias.

O microambiente circundante pode direcionar a plasticidade do macrófago para uma polarização transitória e reversível. Esses fenótipos polarizados refletem o estado pró-inflamatório ou anti-inflamatório e podem mudar ao longo do tempo. Eles podem ser classificados funcionalmente em duas populações principais: macrófagos "ativados classicamente" (M1) e macrófagos "ativados alternativamente" (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Embora seja amplamente aceito que M1 e M2 representam dois terminais de todo o espectro de ativação de macrófagos (Liu et al, 2014), dados recentes (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) permitiu caracterizar essas duas populações da seguinte forma:

• Macrófagos M1: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• Macrófagos M2: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

População do estudo: Os investigadores selecionarão pacientes afetadas por endometriose confirmada histologicamente (casos) e por cistos ovarianos funcionais (controles), que serão submetidas à cirurgia laparoscópica. De acordo com a classificação revisada da American Society for Reproductive Medicine para endometriose (Rock JA, 1995), as pacientes com endometriose serão divididas em 4 grupos: estágio mínimo, leve, moderado e grave da endometriose.

Todo o procedimento laparoscópico será realizado durante a fase proliferativa do ciclo menstrual. Os investigadores excluirão do estudo mulheres afetadas por outros distúrbios pélvicos, doenças circulatórias crônicas, autoimunes ou neoplásicas e que tomaram qualquer medicação anti-inflamatória, hormonal ou imunomoduladora nos últimos 6 meses.

Preparação de amostra de tecido e caracterização de macrófagos: Seções de tecido (tecidos endometrióticos para casos, cistos ovarianos funcionais para controles) serão picadas e incubadas em um coquetel de enzimas contendo concentrações finais de 3,4 mg/ml de pancreatina, 0,1 mg/ml de hialuronidase e 1,6 mg/ml colagenase I em solução salina tamponada de Hank (HBSS) contendo 2 mg/ml de D-glicose a 37°C por 2 horas. Após a digestão, as células serão dispersas por tensão através de uma tela de malha de 250 μm e lavadas com HBSS. As células do tecido serão coradas e fixadas para análise por citometria de fluxo. Antes do isolamento de macrófagos, as células mortas serão removidas da cultura usando o kit de remoção de células mortas. A viabilidade celular será avaliada por exclusão de azul de tripano.

Para avaliar a expressão de superfície de marcadores de macrófagos, amostras de tecido serão coradas para citometria de fluxo com anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo contra CD14, CD68, CCR7 e CD80 para identificar M1, enquanto anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo contra CD14, CD68, CD163 e CD206 para identificar M2.

Análise estatística: A suposição de distribuição normal para variáveis ​​contínuas será testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov quanto à qualidade do ajuste. Todas as análises inferenciais serão realizadas por meio de testes estatísticos não paramétricos. As variáveis ​​com distribuição não normal entre os grupos serão comparadas por meio do teste de Kruskal-Wallis. A faixa de significância estatística será P < 0,05. Além disso, os investigadores usarão testes post hoc de comparação múltipla versus controles ou versus cada estágio para analisar os dados.