Evaluación de macrófagos M1 y M2 en tejido endometriósico de mujeres afectadas por endometriosis en diferentes etapas.

Antecedentes y justificación: la endometriosis es una enfermedad dependiente de estrógenos definida por la presencia ectópica y el crecimiento de tejido endometrial funcional, glándulas y estroma, fuera de la cavidad uterina (Kavoussi et al, 2016). La etiopatogenia de la endometriosis sigue siendo controvertida: pueden estar implicados factores inmunitarios, hormonales, genéticos y epigenéticos, y se han propuesto varias teorías para explicarla.

La enfermedad afecta al 2-10 % de las mujeres en edad reproductiva y al 50 % de las infértiles (Dunselman et al, 2014) y puede causar dolor pélvico (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), sangrado anormal, infertilidad/esterilidad y, en consecuencia, importantes problemas psicológicos (Laganà et al, 2015). La endometriosis se clasifica según el número, el tamaño y la ubicación superficial y/o profunda de los implantes, placas, endometriomas y/o adherencias endometriales. La clasificación de endometriosis más utilizada fue desarrollada por la Sociedad Estadounidense de Medicina Reproductiva (Rock JA, 1995), aunque se pueden usar otras clasificaciones para la endometriosis infiltrante profunda (Haas et al, 2011) o para correlacionar endometriosis e infertilidad (Adamson et al, 2010).

Como se ha demostrado ampliamente (Donnez et al, 2016), en general se acepta que la esterilidad moderada/grave relacionada con la endometriosis se debe a factores mecánicos, es decir, a la distorsión/subversión de la anatomía pélvica normal. Por el contrario, los factores detrás de la infertilidad/subfertilidad relacionada con la endometriosis mínima/leve son menos claros. Sin embargo, hasta la fecha ninguno de los mecanismos hipotéticos explicaba exhaustivamente la infertilidad relacionada con la endometriosis, mientras que es posible que dicha enfermedad sea causada por múltiples factores en conjunto, incluidas las modificaciones genéticas y epigenéticas (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

La evidencia acumulada (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) sugiere que el microambiente peritoneal de las mujeres afectadas por endometriosis sufre una serie de fenómenos reparadores inflamatorios locales, con la participación de macrófagos residentes y la atracción y reclutamiento de mononucleares periféricos. células (monocitos y linfocitos) de la sangre a la cavidad peritoneal: durante la endometriosis se produce una ruptura en la homeostasis endometrial y peritoneal causada por la proliferación celular dirigida por citoquinas (Pizzo et al, 2002) y la desregulación de la apoptosis (Sturlese et al, 2011; Salmeri et al, 2015).

Los monocitos juegan un papel clave durante la inmunidad adaptativa, ya que migran en sitios de infección o inflamación, se diferencian en macrófagos y actúan como Células Presentadoras de Antígenos (APC).

Desde su primera identificación de fagocitosis por Elie Metchnikoff en Messina (JAMA, 1968), después de experimentar con larvas de estrellas de mar, muchos avances nos permitieron tener una visión amplia de los macrófagos además de su papel como células fagocíticas.

El microambiente circundante puede dirigir la plasticidad de los macrófagos hacia una polarización transitoria y reversible. Estos fenotipos polarizados reflejan el estado proinflamatorio o antiinflamatorio y pueden cambiar con el tiempo. Podrían clasificarse funcionalmente en dos poblaciones principales: macrófagos "activados clásicamente" (M1) y macrófagos "activados alternativamente" (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Aunque está ampliamente aceptado que M1 y M2 representan dos terminales del espectro completo de activación de macrófagos (Liu et al, 2014), datos recientes (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) permitió caracterizar estas dos poblaciones de la siguiente manera:

• Macrófagos M1: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• Macrófagos M2: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Población de estudio: Los investigadores seleccionarán pacientes afectadas por endometriosis confirmada histológicamente (casos) y por quistes funcionales de ovario (controles), que serán sometidas a cirugía laparoscópica. De acuerdo con la clasificación revisada de la Sociedad Estadounidense de Medicina Reproductiva para la endometriosis (Rock JA, 1995), las pacientes con endometriosis se dividirán en 4 grupos: estadios mínimos, leves, moderados y graves de endometriosis.

Todo el procedimiento laparoscópico se realizará durante la fase proliferativa del ciclo menstrual. Los investigadores excluirán del estudio a las mujeres afectadas por otros trastornos pélvicos, enfermedades circulatorias crónicas, autoinmunes o neoplásicas y que hayan tomado algún medicamento antiinflamatorio, hormonal o inmunomodulador en los 6 meses anteriores.

Preparación de muestras de tejido y caracterización de macrófagos: Se triturarán secciones de tejido (tejidos endometriósicos para casos, quistes funcionales de ovario para controles) y se incubarán en un cóctel de enzimas que contiene concentraciones finales de 3,4 mg/ml de pancreatina, 0,1 mg/ml de hialuronidasa y 1,6 mg/ml colagenasa I en solución salina tamponada de Hank (HBSS) que contiene 2 mg/ml de D-glucosa a 37°C durante 2 horas. Después de la digestión, las células se dispersarán filtrándolas a través de un tamiz de malla de 250 μm y se lavarán con HBSS. Las células de tejido se teñirán y fijarán para el análisis de citometría de flujo. Antes del aislamiento de los macrófagos, las células muertas se eliminarán del cultivo utilizando el kit de eliminación de células muertas. La viabilidad celular se evaluará mediante exclusión con azul de tripán.

Para evaluar la expresión superficial de los marcadores de macrófagos, las muestras de tejido se tiñerán para citometría de flujo con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD14, CD68, CCR7 y CD80 para identificar M1, mientras que los anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD14, CD68, CD163 y CD206 para identificar M2.

Análisis estadístico: La suposición de distribución normal para variables continuas se probará mediante la prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov. Todos los análisis inferenciales se realizarán utilizando pruebas estadísticas no paramétricas. Las variables que no se distribuyen normalmente entre los grupos se compararán mediante la prueba de Kruskal-Wallis. El rango de significancia estadística será P < .05. Además, los investigadores utilizarán pruebas de comparación múltiple post hoc frente a controles o frente a cada etapa para analizar los datos.