Evaluering af M1- og M2-makrofager i endometriotisk væv hos kvinder ramt af endometriose på forskellige stadier.

Baggrund og begrundelse: Endometriose er en østrogenafhængig sygdom defineret af ektopisk tilstedeværelse og vækst af funktionelt endometrievæv, kirtler og stroma uden for livmoderhulen (Kavoussi et al, 2016). Ætiopatogenesen af ​​endometriose er stadig kontroversiel: immune, hormonelle, genetiske og epigenetiske faktorer kan alle være involveret, og flere teorier er blevet foreslået for at forklare det.

Sygdommen rammer 2-10 % af kvinder i den fødedygtige alder og 50 % af de infertile (Dunselman et al, 2014) og kan forårsage bækkensmerter (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), unormal blødning, infertilitet/sterilitet og følgelig vigtige psykologiske problemer (Laganà et al, 2015). Endometriose klassificeres afhængigt af antallet, størrelsen og den overfladiske og/eller dybe placering af endometrieimplantater, plaques, endometriomer og/eller adhæsioner. Den mest anvendte klassifikation af endometriose er udviklet af American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), selvom anden klassifikation kan bruges til dyb infiltrerende endometriose (Haas et al, 2011) eller til at korrelere endometriose og infertilitet (Adamson et al. 2010).

Som det er vidt bevist (Donnez et al, 2016), er det generelt accepteret, at moderat/svær endometriose-relateret sterilitet skyldes mekaniske faktorer, nemlig forvrængning/undergravning af den almindelige bækkenanatomi. Tværtimod er faktorerne bag infertilitet/subfertilitet relateret til minimal/mild endometriose mindre tydelige. Ikke desto mindre til dato har ingen af ​​de hypoteserede mekanismer udtømmende forklaret infertiliteten relateret til endometriose, mens det er muligt, at en sådan sygdom er forårsaget af flere faktorer i det hele taget, herunder genetiske og epigenetiske modifikationer (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Akkumulerende beviser (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) tyder på, at det peritoneale mikromiljø hos kvinder, der er ramt af endometriose, gennemgår en række lokale inflammatorisk-reparative fænomener med involvering af residente makrofager og tiltrækning og rekruttering af perifere mononukleære fænomener. celler (monocytter og lymfocytter) fra blodet ind i peritonealhulen: under endometriose sker en nedbrydning af endometrie- og peritoneal homeostase forårsaget af cytokin-adresseret celleproliferation (Pizzo et al, 2002) og dysregulering af apoptose (Sturlese et al, 2011; Salmeri11, 2011). et al., 2015).

Monocytter spiller en nøglerolle under adaptiv immunitet, da de migrerer på steder med infektion eller inflammation, differentierer i makrofager og fungerer som antigenpræsenterende celler (APC'er).

Siden deres første identifikation af fagocytose af Elie Metchnikoff i Messina (JAMA, 1968), efter at have eksperimenteret på søstjernens larver, har mange fremskridt gjort det muligt for os at have et bredt overblik over makrofager bortset fra deres rolle som fagocytiske celler.

Det omgivende mikromiljø kan adressere makrofagens plasticitet mod en forbigående og reversibel polarisering. Disse polariserede fænotyper afspejler den proinflammatoriske eller antiinflammatoriske status og kan ændre sig over tid. De kunne funktionelt klassificeres i to hovedpopulationer: "klassisk aktiverede" makrofager (M1) og "alternativt aktiverede" makrofager (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Selvom det er almindeligt accepteret, at M1 og M2 repræsenterer to terminaler af hele spektret af makrofagaktivering (Liu et al, 2014), er nyere data (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) tilladt at karakterisere disse to populationer som følger:

• M1 makrofager: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 makrofager: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Undersøgelsespopulation: Efterforskerne vil udvælge patienter, der er ramt af histologisk bekræftet endometriose (tilfælde) og af ovariefunktionelle cyster (kontroller), som vil gennemgå laparoskopisk kirurgi. I overensstemmelse med den reviderede American Society for Reproductive Medicine klassifikation for endometriose (Rock JA, 1995), vil endometriotiske patienter blive opdelt i 4 grupper: minimale, milde, moderate og svære stadier af endometriose.

Al den laparoskopiske procedure vil blive udført i den proliferative fase af menstruationscyklussen. Efterforskerne vil fra undersøgelsen udelukke kvinder, der er ramt af andre bækkensygdomme, kroniske kredsløbssygdomme, autoimmune eller neoplastiske sygdomme, og som har taget anti-inflammatorisk eller hormonel eller immunmodulerende medicin i de foregående 6 måneder.

Vævsprøveforberedelse og makrofagkarakterisering: Vævssnit (endometriotisk væv til tilfælde, ovariefunktionelle cyster til kontroller) vil blive hakket og inkuberet i en enzymcocktail indeholdende slutkoncentrationer på 3,4 mg/ml pancreatin, 0,1 mg/ml hyaluronidase og 1,6 mg/ml collagenase I i Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) indeholdende 2 mg/ml D-glucose ved 37°C i 2 timer. Efter fordøjelse vil cellerne blive spredt ved at sigte gennem en 250 μm mesh-skærm og vasket med HBSS. Vævsceller vil blive farvet og fikseret til flowcytometrisk analyse. Før makrofagisolering vil døde celler blive fjernet fra kulturen ved hjælp af kittet til fjernelse af døde celler. Cellelevedygtighed vil blive vurderet ved trypanblåt udelukkelse.

For at vurdere overfladeekspression af makrofagmarkører vil vævsprøver blive farvet til flowcytometri med fluorokrom-konjugerede monoklonale antistoffer mod CD14, CD68, CCR7 og CD80 for at identificere M1, mens fluorokrom-konjugerede monoklonale antistoffer mod CD14, CD68, CD163 for at identificere og CD200 M2.

Statistisk analyse: Antagelsen om normalfordeling for kontinuerte variable vil blive testet ved Kolmogorov-Smirnov test for god pasform. Alle inferentielle analyser vil blive udført ved hjælp af ikke-parametriske statistiske test. Ikke-normalfordelte variable mellem grupperne vil blive sammenlignet ved hjælp af Kruskal-Wallis testen. Intervallet for statistisk signifikans vil være P < 0,05. Derudover vil efterforskerne bruge post hoc multiple sammenligningstests enten versus kontroller eller versus hvert trin til at analysere data.