Évaluation des macrophages M1 et M2 dans le tissu endométriotique des femmes atteintes d'endométriose à différents stades.

Contexte et justification : L'endométriose est une maladie dépendante des œstrogènes définie par la présence ectopique et la croissance de tissu endométrial fonctionnel, de glandes et de stroma, en dehors de la cavité utérine (Kavoussi et al, 2016). L'étiopathogénie de l'endométriose reste encore controversée : des facteurs immunitaires, hormonaux, génétiques et épigénétiques peuvent tous être impliqués, et plusieurs théories ont été proposées pour l'expliquer.

La maladie touche 2 à 10 % des femmes en âge de procréer et 50 % de celles qui sont infertiles (Dunselman et al, 2014) et peut provoquer des douleurs pelviennes (Triolo et al, 2013 ; Butticè et al, 2013), des saignements anormaux, l'infertilité/stérilité et, par conséquent, des problèmes psychologiques importants (Laganà et al, 2015). L'endométriose est classée en fonction du nombre, de la taille et de la localisation superficielle et/ou profonde des implants endométriaux, des plaques, des endométriomes et/ou des adhérences. La classification la plus utilisée de l'endométriose a été développée par l'American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), bien qu'une autre classification puisse être utilisée pour l'endométriose infiltrante profonde (Haas et al, 2011) ou pour corréler l'endométriose et l'infertilité (Adamson et al, 2010).

Comme largement démontré (Donnez et al, 2016), il est généralement admis que la stérilité modérée/sévère liée à l'endométriose est due à des facteurs mécaniques, à savoir à la distorsion/subversion de l'anatomie pelvienne régulière. Au contraire, les facteurs à l'origine de l'infertilité/sous-fertilité liée à une endométriose minime/légère sont moins clairs. Néanmoins, à ce jour, aucun des mécanismes hypothétiques n'a expliqué de manière exhaustive l'infertilité liée à l'endométriose, alors qu'il est possible qu'une telle maladie soit causée par de multiples facteurs, y compris des modifications génétiques et épigénétiques (Sofo et al, 2015 ; Maniglio et al, 2016).

De nombreuses preuves (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) suggèrent que le microenvironnement péritonéal des femmes atteintes d'endométriose subit un certain nombre de phénomènes inflammatoires-réparateurs locaux, avec l'implication de macrophages résidents et l'attraction et le recrutement de mononucléaires périphériques. cellules (monocytes et lymphocytes) du sang dans la cavité péritonéale : au cours de l'endométriose, une rupture se produit dans l'homéostasie endométriale et péritonéale causée par la prolifération cellulaire adressée par les cytokines (Pizzo et al, 2002) et la dérégulation de l'apoptose (Sturlese et al, 2011 ; Salmeri et al, 2015).

Les monocytes jouent un rôle clé au cours de l'immunité adaptative, car ils migrent dans les sites d'infection ou d'inflammation, se différencient en macrophages et agissent comme des cellules présentatrices d'antigènes (CPA).

Depuis leur première identification de la phagocytose par Elie Metchnikoff à Messine (JAMA, 1968), après des expérimentations sur les larves d'étoiles de mer, de nombreuses avancées nous ont permis d'avoir un large aperçu des macrophages en dehors de leur rôle de cellules phagocytaires.

Le microenvironnement environnant peut adresser la plasticité des macrophages vers une polarisation transitoire et réversible. Ces phénotypes polarisés reflètent le statut pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire et peuvent évoluer dans le temps. Ils pourraient être classés fonctionnellement en deux populations principales : les macrophages "classiquement activés" (M1) et les macrophages "alternativement activés" (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Bien qu'il soit largement admis que M1 et M2 représentent deux terminaux du spectre complet d'activation des macrophages (Liu et al, 2014), des données récentes (Locati et al, 2013 ; Mantovani et al, 2013 ; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) permis de caractériser ces deux populations comme suit :

• Macrophages M1 : CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• Macrophages M2 : CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Population à l'étude : les enquêteurs sélectionneront des patientes atteintes d'endométriose confirmée histologiquement (cas) et de kystes fonctionnels ovariens (témoins), qui subiront une chirurgie laparoscopique. Conformément à la classification révisée de l'American Society for Reproductive Medicine pour l'endométriose (Rock JA, 1995), les patientes atteintes d'endométriose seront divisées en 4 groupes : stades minimes, légers, modérés et sévères de l'endométriose.

Toute la procédure laparoscopique sera effectuée pendant la phase proliférative du cycle menstruel. Les investigateurs excluront de l'étude les femmes atteintes d'autres troubles pelviens, d'une maladie circulatoire chronique, auto-immune ou néoplasique et qui ont pris des médicaments anti-inflammatoires ou hormonaux ou immunomodulateurs au cours des 6 mois précédents.

Préparation des échantillons de tissus et caractérisation des macrophages : des coupes de tissus (tissus d'endométriose pour les cas, kystes fonctionnels ovariens pour les témoins) seront hachées et incubées dans un cocktail d'enzymes contenant des concentrations finales de 3,4 mg/ml de pancréatine, 0,1 mg/ml d'hyaluronidase et 1,6 mg/ml collagénase I dans une solution saline tamponnée de Hank (HBSS) contenant 2 mg/ml de D-glucose à 37°C pendant 2 heures. Après digestion, les cellules seront dispersées par filtrage à travers un tamis à mailles de 250 μm et lavées avec du HBSS. Les cellules tissulaires seront colorées et fixées pour une analyse par cytométrie en flux. Avant l'isolement des macrophages, les cellules mortes seront retirées de la culture à l'aide du kit d'élimination des cellules mortes. La viabilité cellulaire sera évaluée par exclusion du bleu trypan.

Pour évaluer l'expression de surface des marqueurs de macrophages, des échantillons de tissus seront colorés pour la cytométrie en flux avec des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre CD14, CD68, CCR7 et CD80 pour identifier M1, tandis que des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre CD14, CD68, CD163 et CD206 pour identifier M2.

Analyse statistique : L'hypothèse de distribution normale pour les variables continues sera testée par le test de Kolmogorov-Smirnov pour la qualité de l'ajustement. Toutes les analyses inférentielles seront effectuées à l'aide de tests statistiques non paramétriques. Les variables distribuées non normalement entre les groupes seront comparées à l'aide du test de Kruskal-Wallis. La plage de signification statistique sera P < 0,05. De plus, les enquêteurs utiliseront des tests de comparaison multiples post hoc soit par rapport aux témoins, soit par rapport à chaque étape pour analyser les données.