Ocena makrofagów M1 i M2 w tkance endometrialnej kobiet dotkniętych endometriozą na różnych etapach.

Tło i uzasadnienie: Endometrioza jest chorobą zależną od estrogenów, definiowaną przez ektopową obecność i wzrost funkcjonalnej tkanki endometrium, gruczołów i zrębu, poza jamą macicy (Kavoussi i in., 2016). Etiopatogeneza endometriozy nadal pozostaje kontrowersyjna: czynniki immunologiczne, hormonalne, genetyczne i epigenetyczne mogą być zaangażowane, a kilka teorii zostało zaproponowanych, aby to wyjaśnić.

Choroba dotyka 2-10% kobiet w wieku rozrodczym i 50% kobiet niepłodnych (Dunselman i in., 2014) i może powodować ból miednicy (Triolo i in., 2013; Butticè i in., 2013), nieprawidłowe krwawienia, niepłodność/bezpłodność a co za tym idzie, ważnych problemów psychologicznych (Laganà i in., 2015). Endometriozę klasyfikuje się w zależności od liczby, wielkości oraz powierzchownego i/lub głębokiego umiejscowienia implantów endometrialnych, płytek, endometriozy i/lub zrostów. Najczęściej stosowana klasyfikacja endometriozy została opracowana przez Amerykańskie Towarzystwo Medycyny Rozrodu (Rock JA, 1995), chociaż można zastosować inną klasyfikację w przypadku endometriozy głęboko naciekającej (Haas i wsp., 2011) lub w celu skorelowania endometriozy i niepłodności (Adamson i wsp., 2010).

Jak szeroko udowodniono (Donnez i in., 2016), ogólnie przyjmuje się, że umiarkowana/ciężka bezpłodność związana z endometriozą jest spowodowana czynnikami mechanicznymi, a mianowicie zniekształceniem/odwróceniem prawidłowej anatomii miednicy. Wręcz przeciwnie, czynniki stojące za niepłodnością/obniżeniem płodności związane z minimalną/łagodną endometriozą są mniej jasne. Niemniej jednak do tej pory żaden z hipotetycznych mechanizmów nie wyjaśnił wyczerpująco niepłodności związanej z endometriozą, podczas gdy możliwe jest, że taka choroba jest spowodowana łącznie wieloma czynnikami, w tym modyfikacjami genetycznymi i epigenetycznymi (Sofo i in., 2015; Maniglio i in., 2016).

Zgromadzone dowody (Laganà i in., 2013; Laganà i in., 2016) sugerują, że mikrośrodowisko otrzewnej kobiet dotkniętych endometriozą podlega szeregowi lokalnych zjawisk zapalnych i naprawczych, z udziałem rezydentnych makrofagów oraz przyciąganiem i rekrutacją obwodowych jednojądrzastych komórki (monocyty i limfocyty) z krwi do jamy otrzewnej: podczas endometriozy następuje załamanie homeostazy endometrium i otrzewnej spowodowane proliferacją komórek adresowanych do cytokin (Pizzo i in., 2002) oraz rozregulowaniem apoptozy (Sturlese i in., 2011; Salmeri i in., 2015).

Monocyty odgrywają kluczową rolę podczas odporności nabytej, ponieważ migrują w miejscach infekcji lub zapalenia, różnicują się w makrofagach i działają jako komórki prezentujące antygen (APC).

Od czasu pierwszej identyfikacji fagocytozy przez Elie Metchnikoffa w Mesynie (JAMA, 1968), po eksperymentach na larwach rozgwiazdy, wiele kroków naprzód pozwoliło nam mieć szeroki przegląd makrofagów poza ich rolą jako komórek fagocytarnych.

Otaczające mikrośrodowisko może wpływać na plastyczność makrofagów w kierunku przejściowej i odwracalnej polaryzacji. Te spolaryzowane fenotypy odzwierciedlają stan prozapalny lub przeciwzapalny i mogą zmieniać się w czasie. Można je funkcjonalnie podzielić na dwie główne populacje: makrofagi „aktywowane klasycznie” (M1) i makrofagi „aktywowane alternatywnie” (M2) (Sica i Mantovani, 2012). Chociaż powszechnie przyjmuje się, że M1 i M2 reprezentują dwa terminale pełnego spektrum aktywacji makrofagów (Liu i in., 2014), ostatnie dane (Locati i in., 2013; Mantovani i in., 2013; Capobianco i Rovere-Querini, 2013) pozwoliło scharakteryzować te dwie populacje w następujący sposób:

• Makrofagi M1: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• Makrofagi M2: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Badana populacja: Badacze wybiorą pacjentki z potwierdzoną histologicznie endometriozą (przypadki) i torbielami czynnościowymi jajników (grupa kontrolna), które zostaną poddane operacji laparoskopowej. Zgodnie z poprawioną klasyfikacją endometriozy Amerykańskiego Towarzystwa Medycyny Rozrodu (Rock JA, 1995), pacjentki z endometriozą zostaną podzielone na 4 grupy: minimalne, łagodne, umiarkowane i ciężkie stadia endometriozy.

Wszystkie zabiegi laparoskopowe będą wykonywane w fazie proliferacyjnej cyklu miesiączkowego. Badacze wykluczą z badania kobiety dotknięte innymi zaburzeniami miednicy mniejszej, przewlekłymi chorobami układu krążenia, autoimmunologicznymi lub nowotworowymi, które w ciągu ostatnich 6 miesięcy przyjmowały jakiekolwiek leki przeciwzapalne, hormonalne lub immunomodulujące.

Przygotowanie próbek tkanek i charakterystyka makrofagów: Skrawki tkanek (tkanki endometrialne w przypadku przypadków, funkcjonalne torbiele jajników w przypadku kontroli) zostaną zmielone i inkubowane w koktajlu enzymatycznym zawierającym końcowe stężenia 3,4 mg/ml pankreatyny, 0,1 mg/ml hialuronidazy i 1,6 mg/ml kolagenazę I w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) zawierającym 2 mg/ml D-glukozy w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po trawieniu komórki zostaną rozproszone przez przecedzenie przez sito o oczkach 250 μm i przemyte HBSS. Komórki tkankowe zostaną wybarwione i utrwalone do analizy metodą cytometrii przepływowej. Przed izolacją makrofagów martwe komórki zostaną usunięte z hodowli za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek. Żywotność komórek zostanie oceniona przez wykluczenie błękitem trypanu.

Aby ocenić ekspresję powierzchniową markerów makrofagów, próbki tkanek zostaną wybarwione do cytometrii przepływowej skoniugowanymi z fluorochromem przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD14, CD68, CCR7 i CD80 w celu identyfikacji M1, podczas gdy skoniugowane z fluorochromem przeciwciała monoklonalne przeciwko CD14, CD68, CD163 i CD206 w celu identyfikacji M2.

Analiza statystyczna: Założenie o rozkładzie normalnym dla zmiennych ciągłych zostanie sprawdzone testem Kołmogorowa-Smirnowa na dobroć dopasowania. Wszystkie analizy wnioskowania zostaną przeprowadzone przy użyciu nieparametrycznych testów statystycznych. Zmienne o rozkładzie innym niż normalny między grupami zostaną porównane za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Zakres istotności statystycznej wyniesie P < 0,05. Ponadto badacze wykorzystają wielokrotne testy porównawcze post hoc z kontrolami lub z każdym etapem w celu przeanalizowania danych.