Evaluering av M1- og M2-makrofager i endometriotisk vev hos kvinner berørt av endometriose på forskjellige stadier.

Bakgrunn og begrunnelse: Endometriose er en østrogenavhengig sykdom definert av ektopisk tilstedeværelse og vekst av funksjonelt endometrievev, kjertler og stroma, utenfor livmorhulen (Kavoussi et al, 2016). Etiopatogenesen av endometriose er fortsatt kontroversiell: immune, hormonelle, genetiske og epigenetiske faktorer kan alle være involvert, og flere teorier har blitt foreslått for å forklare det.

Sykdommen rammer 2-10 % av kvinner i reproduktiv alder og 50 % av de infertile (Dunselman et al, 2014) og kan forårsake bekkensmerter (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), unormale blødninger, infertilitet/sterilitet og følgelig viktige psykologiske problemer (Laganà et al, 2015). Endometriose er klassifisert avhengig av antall, størrelse og overfladisk og/eller dyp plassering av endometrieimplantater, plakk, endometriomer og/eller adhesjoner. Den mest brukte klassifiseringen av endometriose ble utviklet av American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), selv om annen klassifisering kan brukes for dyp infiltrerende endometriose (Haas et al, 2011) eller for å korrelere endometriose og infertilitet (Adamson et al, 2010).

Som allment bevist (Donnez et al, 2016), er det generelt akseptert at moderat/alvorlig endometriose-relatert sterilitet skyldes mekaniske faktorer, nemlig forvrengning/subversjon av den vanlige bekkenanatomien. Tvert imot er faktorene bak infertilitet/subfertilitet knyttet til minimal/mild endometriose mindre tydelige. Til dags dato har likevel ingen av de antatte mekanismene uttømmende forklart infertiliteten relatert til endometriose, mens det er mulig at en slik sykdom er forårsaket av flere faktorer totalt, inkludert genetiske og epigenetiske modifikasjoner (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Akkumulerende bevis (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) tyder på at det peritoneale mikromiljøet til kvinner som er rammet av endometriose gjennomgår en rekke lokale inflammatorisk-reparative fenomener, med involvering av fastboende makrofager, og tiltrekning og rekruttering av perifere mononukleære celler (monocytter og lymfocytter) fra blodet inn i bukhulen: under endometriose oppstår et sammenbrudd i endometrial og peritoneal homeostase forårsaket av cytokin-adressert celleproliferasjon (Pizzo et al, 2002) og dysregulering av apoptose (Sturlese et al, 2011; Salmeri11, 2011). et al, 2015).

Monocytter spiller en nøkkelrolle under adaptiv immunitet, siden de migrerer på steder med infeksjon eller betennelse, differensierer i makrofager og fungerer som antigenpresenterende celler (APC).

Siden deres første identifisering av fagocytose av Elie Metchnikoff i Messina (JAMA, 1968), etter å ha eksperimentert på larvene til sjøstjerner, har mange skritt fremover tillatt oss å ha en bred oversikt over makrofager bortsett fra deres rolle som fagocytiske celler.

Det omkringliggende mikromiljøet kan adressere makrofagplastisiteten mot en forbigående og reversibel polarisering. Disse polariserte fenotypene gjenspeiler den proinflammatoriske eller antiinflammatoriske statusen og kan endre seg over tid. De kan funksjonelt klassifiseres i to hovedpopulasjoner: "klassisk aktiverte" makrofager (M1) og "alternativt aktiverte" makrofager (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Selv om det er allment akseptert at M1 og M2 representerer to terminaler av hele spekteret av makrofagaktivering (Liu et al, 2014), nyere data (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) lov til å karakterisere disse to populasjonene som følger:

• M1 makrofager: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 makrofager: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Studiepopulasjon: Etterforskerne vil velge pasienter som er berørt av histologisk bekreftet endometriose (tilfeller) og av funksjonelle cyster på eggstokkene (kontroller), som skal gjennomgå laparoskopisk kirurgi. I samsvar med den reviderte American Society for Reproductive Medicine-klassifiseringen for endometriose (Rock JA, 1995), vil endometriotiske pasienter deles inn i 4 grupper: minimale, milde, moderate og alvorlige stadier av endometriose.

All den laparoskopiske prosedyren vil bli utført under den proliferative fasen av menstruasjonssyklusen. Etterforskerne vil ekskludere fra studien kvinner som er berørt av andre bekkenlidelser, kronisk sirkulasjonssykdom, autoimmun eller neoplastisk sykdom og som tok noen antiinflammatorisk eller hormonell eller immunmodulerende medisin i løpet av de foregående 6 månedene.

Preparering av vevsprøve og makrofagkarakterisering: Vevsseksjoner (endometriotisk vev for tilfeller, ovariefunksjonelle cyster for kontroller) vil bli hakket og inkubert i en enzymcocktail som inneholder sluttkonsentrasjoner på 3,4 mg/ml pankreatin, 0,1 mg/ml hyaluronidase og 1,6 mg/ml kollagenase I i Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) inneholdende 2 mg/ml D-glukose ved 37°C i 2 timer. Etter fordøyelsen vil cellene bli spredt ved siling gjennom en 250 μm mesh-skjerm og vasket med HBSS. Vevsceller vil bli farget og fiksert for flowcytometrisk analyse. Før makrofagisolering vil døde celler bli fjernet fra kulturen ved å bruke settet for fjerning av døde celler. Cellelevedyktighet vil bli vurdert ved trypanblått eksklusjon.

For å vurdere overflateekspresjon av makrofagmarkører, vil vevsprøver farges for flowcytometri med fluorokrom-konjugerte monoklonale antistoffer mot CD14, CD68, CCR7 og CD80 for å identifisere M1, mens fluorokrom-konjugerte monoklonale antistoffer mot CD14, CD68, CD163 for å identifisere og CD200 M2.

Statistisk analyse: Forutsetningen om normalfordeling for kontinuerlige variabler vil bli testet med Kolmogorov-Smirnov-testen for god passform. Alle konklusjonsanalyser vil bli utført ved bruk av ikke-parametriske statistiske tester. Ikke-normalfordelte variabler mellom gruppene vil bli sammenlignet ved hjelp av Kruskal-Wallis-testen. Området for statistisk signifikans vil være P < 0,05. I tillegg vil etterforskerne bruke post hoc multiple sammenligningstester enten kontra kontroller eller mot hvert trinn for å analysere data.