Az M1 és M2 makrofágok értékelése különböző stádiumú endometriózissal érintett nők endometriotikus szövetében.

Háttér és indoklás: Az endometriózis egy ösztrogénfüggő betegség, amelyet a funkcionális endometrium szövet, mirigyek és stroma méhen kívüli jelenléte és növekedése határoz meg a méh üregen kívül (Kavoussi et al, 2016). Az endometriózis etiopatogenezise továbbra is ellentmondásos: immun-, hormonális, genetikai és epigenetikai tényezők egyaránt szerepet játszhatnak, és számos elméletet javasoltak ennek magyarázatára.

A betegség a reproduktív korú nők 2-10%-át és a terméketlenek 50%-át érinti (Dunselman és mtsai, 2014), és kismedencei fájdalmat (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), kóros vérzést, meddőséget/sterilitást okozhat. és ebből következően fontos pszichológiai problémák (Laganà et al, 2015). Az endometriózis osztályozása az endometrium implantátumok, plakkok, endometriómák és/vagy adhéziók számától, méretétől és felületi és/vagy mély elhelyezkedésétől függően történik. Az endometriózis leggyakrabban használt osztályozását az American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995) dolgozta ki, bár más osztályozás is használható a mélyen beszűrődő endometriózisra (Haas és mtsai, 2011) vagy az endometriózis és a meddőség összefüggésére (Adamson et al, 2010).

Amint azt széles körben bebizonyították (Donnez és mtsai, 2016), általánosan elfogadott, hogy a mérsékelt/súlyos endometriózissal összefüggő sterilitás mechanikai tényezők, nevezetesen a kismedencei anatómia szabályos torzulása/felforgatása következménye. Éppen ellenkezőleg, a minimális/enyhe endometriózishoz kapcsolódó meddőség/szubfertilitás hátterében álló tényezők kevésbé egyértelműek. Mindazonáltal a mai napig egyik feltételezett mechanizmus sem magyarázta kimerítően az endometriózissal összefüggő meddőséget, bár lehetséges, hogy ezt a betegséget összesen több tényező okozza, beleértve a genetikai és epigenetikai módosulásokat (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

A felhalmozódó bizonyítékok (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) azt sugallják, hogy az endometriózisban szenvedő nők peritoneális mikrokörnyezete számos lokális gyulladásos-reparatív jelenségen megy keresztül, a rezidens makrofágok bevonásával, valamint a perifériás mononukleáris vonzás és toborzás révén. sejtek (monociták és limfociták) a vérből a peritoneális üregbe: az endometriózis során az endometrium és a peritoneális homeosztázis lebomlása következik be, amelyet a citokin-címzett sejtproliferáció (Pizzo és mtsai, 2002) és az apoptózis szabályozási zavara (Sturlese et al, 2011; et al, 2015).

A monociták kulcsszerepet játszanak az adaptív immunitás során, mivel fertőzés vagy gyulladás helyén vándorolnak, makrofágokban differenciálódnak, és antigénprezentáló sejtekként (APC) működnek.

Amióta Elie Metchnikoff először azonosította a fagocitózist Messinában (JAMA, 1968), a tengeri csillagok lárváin végzett kísérletezése után számos előrelépés lehetővé tette számunkra, hogy széles körű áttekintést kapjunk a makrofágokról, eltekintve fagocita sejtként betöltött szerepüktől.

A környező mikrokörnyezet a makrofágok plaszticitását átmeneti és reverzibilis polarizáció felé irányíthatja. Ezek a polarizált fenotípusok a proinflammatorikus vagy gyulladásgátló állapotot tükrözik, és idővel változhatnak. Funkcionálisan két fő populációba sorolhatók: „klasszikusan aktivált” makrofágok (M1) és „alternatívan aktivált” makrofágok (M2) (Sica és Mantovani, 2012). Bár széles körben elfogadott, hogy az M1 és az M2 a makrofágaktiválás teljes spektrumának két végpontja (Liu és mtsai, 2014), a legújabb adatok (Locati és mtsai, 2013; Mantovani és mtsai, 2013; Capobianco és Rovere-Querini, 2013) a következőképpen jellemezhetjük ezt a két populációt:

• M1 Makrofágok: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 makrofágok: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Vizsgálati populáció: A vizsgálók szövettanilag igazolt endometriózissal (esetek) és petefészek-funkcionális cisztákkal (kontroll) érintett betegeket választanak ki, akiken laparoszkópos műtétet hajtanak végre. Az American Society for Reproductive Medicine endometriosisra vonatkozó felülvizsgált osztályozása szerint (Rock JA, 1995) az endometriózisos betegeket 4 csoportba osztják: az endometriózis minimális, enyhe, közepes és súlyos stádiumai.

Az összes laparoszkópos eljárást a menstruációs ciklus proliferatív szakaszában kell elvégezni. A vizsgálók kizárják a vizsgálatból azokat a nőket, akik más kismedencei betegségben, krónikus keringési, autoimmun vagy daganatos betegségben szenvedtek, és akik az elmúlt 6 hónapban gyulladáscsökkentő, hormonális vagy immunmoduláló gyógyszert szedtek.

Szövetminta-előkészítés és makrofágok jellemzése: A szövetmetszeteket (endometriózisos szövetek esetenként, petefészek funkcionális ciszták kontrollként) ledarálják és 3,4 mg/ml pankreatint, 0,1 mg/ml hialuronidázt és 1,6 mg/ml végkoncentrációt tartalmazó enzimkoktélban inkubálják. kollagenáz I 2 mg/ml D-glükózt tartalmazó Hank-féle pufferolt sóoldatban (HBSS) 37 °C-on 2 órán át. Az emésztés után a sejteket 250 μm-es szitán való átszűréssel diszpergálják, és HBSS-sel mossák. A szöveti sejteket megfestjük és rögzítjük az áramlási citometriás elemzéshez. A makrofágok izolálása előtt az elhalt sejteket eltávolítják a tenyészetből az elhalt sejteltávolító készlet segítségével. A sejtek életképességét tripánkék kizárással értékeljük.

A makrofág markerek felszíni expressziójának értékeléséhez szövetmintákat festenek áramlási citometriához fluorokróm-konjugált monoklonális antitestekkel CD14, CD68, CCR7 és CD80 ellen az M1 azonosítása érdekében, míg a fluorokrómhoz konjugált monoklonális antitesteket a CD14, CD36 és CD2, CD2 ellen. M2.

Statisztikai elemzés: A folytonos változók normális eloszlásának feltételezését Kolmogorov-Smirnov teszttel teszteljük az illeszkedés jóságára. Minden következtetési elemzést nem paraméteres statisztikai tesztekkel hajtanak végre. A csoportok közötti nem normál eloszlású változókat Kruskal-Wallis teszttel hasonlítjuk össze. A statisztikai szignifikancia tartománya P < 0,05 lesz. Ezen túlmenően, a vizsgálók post hoc többszörös összehasonlító teszteket is alkalmaznak a kontrollokhoz vagy az egyes szakaszokhoz képest az adatok elemzéséhez.